米曲霉制備麥糟蛋白肽固態發酵培養基優化

肖連冬，于海彥，李慧星，程 爽

（1.南陽理工學院生物與化學工程學院, 河南南陽473000；2.河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室, 河南南陽473000）

麥糟作為啤酒工業的主要副產物以其高蛋白含量[1?3]和產量巨大[4?5]而受到人們重視。利用它作為食品與保健品的原材料來生產高附加值的蛋白肽，具有良好的經濟效益和環境效益，也是對工業糟渣蛋白質資源的開發利用和工業生產可持續發展的具體實踐。目前，活性肽制備主要方法有酸法、酶法和微生物發酵法[6?7]。酸法制備易產生有害物質，排放大量酸性污水，使其應用受到限制；酶法制備蛋白肽一般對原料要求較高，水解程度低，成本高；微生物發酵法是將蛋白酶的發酵生產和蛋白原料的酶解結合在一起，成本低，不產生有害成分，是目前推崇的蛋白肽生產方法。麥糟蛋白肽是將麥糟中蛋白質降解制得低分子量、高活性的肽類[8]，使其不僅具有優良加工特性[9?10]，且具有強生理活性、低免疫原性和高療效性[11?13]。科學研究證明，人體內蛋白質消化后大都以小肽的形式吸收[14?16]，具有很高的營養價值和藥用價值。因此，開發制備具有生物活性的麥糟多肽，有著十分重要的意義。

米曲霉是公認的食品安全生產菌株[17]，具有豐富的蛋白酶系[18]，多應用于食品、醫藥等工業中[19]。采用米曲霉固態發酵生產蛋白肽，具有能耗低、安全性高、接種方便靈活（可直接接種孢子）、可維持性較高等優點[20?21]，目前在肽類生產中已有使用，而用米曲霉發酵麥糟制備蛋白肽尚未見報道。

本試驗利用米曲霉固態發酵技術，通過生物轉化生產麥糟蛋白肽，探討發酵制備麥糟蛋白肽培養基條件。通過單因素實驗和響應曲面法考察影響肽轉化率的因素，優化培養基條件，以期為工業化生產麥糟活性肽提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉（Aspergillus oryzae） 河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室提供；麥糟 南陽市京德啤酒技術開發有限公司（干燥，粉碎過80目篩，粗蛋白含量17.16%）；耐高溫組培封口膜 常德比克曼生物科技有限公司；溴甲酚綠、甲基紅、硫酸鈉、葡萄糖、蔗糖、氯化鈉 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；次甲基藍、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵 分析純，天津市德恩化學試劑有限公司；硫酸銅、三氯乙酸、氫氧化鈉 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；碘化鉀 分析純，天津市永晟精細化工有限公司；牛血清白蛋白 色譜純，北京奧博星生物技術有限責任公司；磷酸二氫鉀 分析純，北京精求化工廠。

LDZW型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺 蘇州凈化；MJ-300-Ⅲ型霉菌培養箱 上海躍進醫療器械有限公司；UV1600-759型紫外可見光分光光度計 上海菁化科技器材有限公司；TDL·40C型低速臺式大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；PHS-3C型pH計

上海儀電科學儀器股份有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；BSA124S型分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基制備 斜面培養基：蔗糖30 g，硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀 1 g，硫酸鎂 0.5 g，氯化鉀 0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，瓊脂 20 g，水 1000 mL，121 ℃ 滅菌20 min。

發酵培養基組成：麥糟、碳源、磷酸二氫鉀、水。用于麥糟固態發酵生產蛋白肽。

1.2.2 斜面試管及孢子懸液制備 采用相同規格試管，每支裝斜面培養基10 mL，枕于高度為1 cm的長木條上，凝固后形成大小相同斜面。接種米曲霉后于28 ℃培養至孢子長滿斜面。

取1支活化菌種斜面，加入10 mL無菌水，用接種環將斜面孢子全部剝離洗下，搖勻，獲得孢子懸液。

1.2.3 麥糟蛋白肽發酵試驗 稱取麥糟樣品5.0 g置于250 mL三角瓶中，封口膜封口，包扎，121 ℃滅菌20 min；另取1支試管，根據料液比加入所需的水量，然后加入一定比例的碳源及磷酸二氫鉀，溶解，121 ℃滅菌20 min；待試管中溶液冷卻至室溫后，接入1 mL孢子懸液，搖勻，制備成含菌拌料水，加入已滅菌的固體麥糟中，攪勻，置于恒溫培養箱中，28 ℃培養96 h。

1.2.4 發酵麥糟蛋白肽的萃取和測定 蛋白肽萃取：取100 mL蒸餾水加入發酵后的固態基質中，于磁力攪拌器上攪拌30 min，4000 r/min離心10 min，收集上清液并定容至100 mL。取上清液5 mL，加入5 mL 10% TCA，搖勻后常溫靜置30 min，4000 r/min離心15 min，得上清液備用。

蛋白肽測定：采用雙縮脲法[22]。取上清液1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，搖勻后常溫靜置30 min，測OD540nm值，計算蛋白肽含量，按公式（1）計算肽轉化率：

蛋白肽測定回歸方程擬合：取不同體積的牛血清蛋白標準溶液，按照樣品測定方法顯色，于波長540 nm下測定吸光值，以蛋白質含量（x）為自變量，以吸光度（y）為因變量，建立回歸方程，得到方程y=0.041x+0.001（R2=0.999）。

1.2.5 單因素試驗 以肽轉化率為考察指標，在由麥糟、碳源、磷酸二氫鉀和水組成的培養基中，以碳源添加量5%、磷酸二氫鉀添加量0.5%、料液比1:2作為基本條件，分別考察不同碳源（淀粉、蔗糖、葡萄糖）、蔗糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、磷酸二氫鉀添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）和料液比（1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5 g·mL?1）對發酵結果的影響。

1.2.6 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，設計Box-Behnken試驗方案[23]進一步研究蔗糖添加量、磷酸二氫鉀添加量、料液比對肽轉化率的影響，考察因素的交互作用及顯著性，優化培養基條件。設變量A、B、C分別代表蔗糖添加量、磷酸二氫鉀添加量、料液比，因素水平及編碼見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Level and code of factors chosen for the trials

1.3 數據處理

實驗重復3次，利用Excel 2007、SPSS 18.0處理實驗數據，采用Minitab 15.1.0.0軟件中Box-Benhnken設計響應面數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源種類對肽轉化率的影響 麥糟中殘留總糖很低[24]，需要外加碳源來補充培養基中碳源不足，保證菌體正常生長代謝。碳源是菌體細胞組成的原料，也是菌體生長發育必需的能源物質。某些碳源是酶的誘導物，選擇適宜的碳源有利于定向促進某些酶的合成[25]。不同碳源對肽轉化率的影響見圖1。由圖1可見，碳源種類對米曲霉發酵生產蛋白肽的影響有明顯差異。三種碳源中以蔗糖作為碳源效果最好，肽轉化率最高，葡萄糖次之，淀粉因為較難利用轉化率較小。蔗糖效果優于葡萄糖的原因是蔗糖更有利于米曲霉的生長[26]和代謝，試驗表明蔗糖對米曲霉的生長有良好的促進作用，能夠使其在生長過程中產生豐富的蛋白酶將麥糟蛋白轉化為多肽。

圖1 不同碳源種類對肽轉化率的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on peptide conversion ratio

通過對實驗數據的方差分析，F=54.36>F0.01=10.92，說明碳源種類對麥糟發酵制備蛋白肽影響極顯著，因此，試驗確定在米曲霉發酵培養基中添加蔗糖作為碳源。

2.1.2 蔗糖添加量對肽轉化率的影響 蛋白肽的發酵生產過程需要大量的碳源來維持其微生物細胞生長繁殖和產酶。蔗糖添加量對肽轉化率的影響見圖2。由圖2可見，蔗糖添加量對麥糟多肽發酵生產影響較大。當蔗糖濃度較低時，肽轉化率隨蔗糖添加量的增加而提高，當蔗糖添加量4%時，肽轉化率達到最高，隨著蔗糖添加量的繼續增加肽轉化率逐漸下降。原因是過多的蔗糖會加速菌體的呼吸作用，導致因溶氧不足而影響菌體的生長和產酶[27]；如果蔗糖含量繼續增加超過限定后會因為高滲透壓造成細胞失水，抑制微生物的生長發酵，肽轉化率下降。實驗得出適宜的蔗糖添加量為4%。

圖2 不同蔗糖添加量對肽轉化率的影響Fig.2 Effects of different amounts of sucrose on peptide conversion ratio

2.1.3 磷酸二氫鉀添加量對肽轉化率的影響 在麥糟中添加磷酸二氫鉀，其目的是提供微生物代謝所需的P、K元素，另有緩沖pH作用。磷酸二氫鉀添加量對米曲霉發酵麥糟生產蛋白肽的影響結果見圖3。由圖3可見，當磷酸二氫鉀濃度低時，隨著鹽濃度增加，肽轉化率增加，磷酸二氫鉀添加量0.5%時，肽轉化率達到最大值25.78%，繼續增加磷酸二氫鉀的添加量，肽轉化率逐步下降，原因是高濃度磷酸鹽對微生物生長代謝產生抑制作用，實驗得出適宜的磷酸二氫鉀添加量為0.5%。

圖3 不同磷酸二氫鉀添加量對肽轉化率的影響Fig.3 Effects of different amounts of potassium dihydrogen phosphate on peptide conversion ratio

2.1.4 料液比對肽轉化率的影響 水是微生物生命活動的基本條件，是微生物與外界營養物質接觸的橋梁，微生物需要從周圍環境中吸收營養物質供其進行代謝活動，因此培養基含水量的高低對微生物的生長代謝有重要影響。對固態發酵而言，含水量低還會影響物料基質的吸水膨脹，從而影響微生物對基質的利用代謝，含水量過高又會影響培養基內溶氧和CO2的排出，微生物難以生長和產酶。料液比對肽轉化率的影響見圖4。由圖4可知，料液比對麥糟發酵生產蛋白肽影響顯著(P<0.05)。隨著水量的增加，物料基質吸水膨脹度增大，培養基中的水促使米曲霉和其產生的蛋白酶與營養物質充分接觸，加速微生物的生長及代謝，因此肽轉化率增加，到料液比達1:3 g·mL?1時，肽轉化率達到最高39.79%，再繼續增加水量，肽轉化率則下降，原因是過高含水量會影響培養基內溶氧和CO2的排出，微生物難以生長和產酶。實驗得出適宜的料液比為 1:3 g·mL?1。

圖4 不同料液比對肽轉化率的影響Fig.4 Effects of different solid-liquid ratios on peptide conversion ratio

2.2 響應面法優化培養基條件

在單因素實驗的基礎上，采用響應曲面法的Box-Behnken試驗方案優化條件，試驗結果見表2。利用Minitab軟件對試驗數據進行分析，所得回歸方程系數顯著性檢驗結果見表3，模型的方差分析結果見表4。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

表4 模型方差分析Table 4 Variance analysis of model

由表3可知，在三因素選擇的水平范圍內，實驗數據分析所得回歸方程系數顯著性檢驗結果為：A、B、C、A2、B2、C2、AC對肽轉化率影響極顯著（P<0.01），AB、BC 對肽轉化率影響不顯著（P>0.05）。自變量A、B、C 對肽轉化率的影響大小關系為：A>B>C，即：蔗糖添加量>磷酸二氫鉀添加量>料液比；各因素回歸擬合后得到回歸方程：

表3 回歸系數顯著性分析Table 3 Significance analysis of regression coefficients

Y=51.0967+3.00875A+1.815B+0.98375C?7.76458 A2?5.71208B2?7.93458C2?0.03AB+2.9425AC?0.205 BC。

根據表4回歸模型方差分析結果，模型P<0.01，表明該二次方程模型具有高度的顯著性；失擬P=0.331>0.05，表明模型失擬項不顯著；該模型決定系數R2=0.9995，調整決定系數R2Adj=0.9987，說明模型擬合度較好，預測值與試驗值具有高度相關性，可用該模型預測米曲霉菌株發酵麥糟制備蛋白肽在不同條件下的肽轉化率。

根據回歸方程得出不同因子的響應面及等高線分析圖見圖5。

響應面及等高線圖可直觀反映各因素之間的交互作用對響應值影響程度，曲面越陡，等密度線越密，影響越顯著[28?32]。由圖5可知，因素A與因素C交互作用響應圖陡峭、等密度線密集，即因素A與因素C交互作用對肽轉化率Y的影響最大，該結果與表3所得結論相吻合。

圖5 各因素交互作用對肽轉化率影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour lines for the interaction effects of various factors on peptide conversion ratio

經過軟件分析優化得到的條件為：A=0.2121，B=0.1515，C=0.0909，即蔗糖添加量為4.2121%、磷酸二氫鉀添加量為0.51515%、料液比為1:3.04545 g·mL?1。該條件下，模型預測肽轉化率為51.6062%。為了方便操作，蔗糖添加量取4.21%、磷酸二氫鉀添加量取0.51%、料液比 1:3 g·mL?1，在此條件下重復 3 次試驗，結果見表5，肽轉化率為50.73%，變異系數1.2%，相對于理論值相對誤差為1.7%，結果穩定可用。

表5 重復實驗結果Table 5 Results of repeated test

3 結論

利用米曲霉固態發酵麥糟生產蛋白肽過程中，確定了麥糟中添加碳源蔗糖更有利于提高蛋白肽轉化率。在單因素試驗的基礎上，對米曲霉發酵制備麥糟蛋白肽的培養基條件進行Box-Behnken響應面優化，得到的最佳培養基條件為：蔗糖添加量4.21%，磷酸氫二鉀添加量 0.51%，料液比 1:3 g·mL?1，該條件下蛋白肽轉化率達50.73%。實驗結果說明，利用米曲霉固態發酵麥糟制備蛋白肽方法可行，肽轉化較高，結果可為麥糟蛋白肽的工業化生產提供參考和依據。