交聯法制備玉米抗性淀粉的工藝優化及理化性質分析

宋文天，盧紅妍，楊鏡琦，方 麗,2，閔偉紅,2，劉春雷,2,

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院, 吉林長春 130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室, 吉林長春 130118）

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）為膳食纖維的組成成分之一，不能被健康人體小腸利用提供葡萄糖，但能由大腸中腸道微生物發酵產生短鏈脂肪酸，有利于有益菌群生長、人體健康[1]。國內外研究發現RS可優化腸道菌群組成[2]、作為糖尿病人的食品基料[3]、減緩慢性腎臟疾病[4]、在結腸健康方面起關鍵作用[5]，同時具有降低膽固醇[6]和Ⅱ型糖尿病患病的風險[7]等生理功能，被廣大學者所關注，日益成為食品領域研究熱點。然而國內商業化生產RS技術并不成熟，我國目前RS的供給大多數來自國外且費用偏高，吉林省作為玉米淀粉出產大省，對玉米抗性淀粉的研究，具有重要的實際應用價值。

化學法制備RS多采用交聯法和酯化法。相比于物理法和酶法，化學法在處理過程中引入化學試劑，不適宜制備可食用的食品。本實驗選取的三偏磷酸鈉是一種無有害副產物且合成條件溫和的交聯劑[8]，可使一種或多種淀粉粒子間發生交聯作用而呈多維立體的空間“網絡”狀態，進而增大分子量，增強淀粉顆粒之間的聯合作用，使結構變得緊密，淀粉性質發生改變[9?10]。使用復合交聯劑制備出的交聯淀粉含量高于單一交聯劑，熱穩定性與抗剪切穩定性等功能優于原淀粉[11?12]，但目前采取復合交聯劑制備RS的研究較少。

基于上述情況，本文以普通玉米淀粉為原料，結合復合交聯劑制備RS的單因素試驗結果，利用響應面優化獲得交聯淀粉制備的最佳工藝條件；在此基礎上，將交聯淀粉的理化特性與酯化淀粉和原淀粉進行對比分析，為玉米抗性淀粉工業化生產及功能食品開發提供了理論基礎，同時為玉米精深加工的創新發展提供了新的思路。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 吉林省杞參食品有限公司；三偏磷酸鈉、檸檬酸、三聚磷酸鈉 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；耐高溫α-淀粉酶（45000 U/mL）和葡萄糖淀粉酶（45000 U/mL） Sigma公司；中溫α-淀粉酶（3700 U/g） 食品級，北京奧博星生物技術有限責任公司。

ZD-2自動電位滴定儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；WFJ 2100可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；71403372-17場發射掃描電子顯微鏡 PHENOM公司；AL-204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IR-Prestuge-21傅里葉紅外光譜 日本島津；Z36HK高速冷凍離心機

HERMLE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗性淀粉制備方法

1.2.1.1 交聯法制備抗性淀粉 參照KAHRAMAN等[13]的方法，稍作修改，將一定質量比的復合交聯劑（三偏磷酸鈉:三聚磷酸鈉=99:1）、10%無水硫酸鈉和玉米淀粉分散在70 mL蒸餾水中（添加劑的重量均基于玉米淀粉的質量）。將淀粉乳pH調整至12.0，一定溫度下水浴加熱，反應一定時間后，再將pH調整到6.5，以終止改性反應；用蒸餾水（洗7次）洗滌，4000 r/min離心5 min，將沉淀物置于50 ℃烘箱去除水分。干燥后的樣品研磨后過100目篩，獲得的篩下物即為待測樣品。

1.2.1.2 檸檬酸酯化法制備抗性淀粉 參照REMYA等[14]的方法，稍作修改；稱取一定質量檸檬酸溶于蒸餾水中，攪拌均勻，配置質量分數為50%檸檬酸溶液。用 10 mol/L NaOH，調pH為3.3，加水稀釋至25 mL，再與25 g淀粉混合放到平皿中，室溫靜置16 h。靜置結束后于50 ℃干燥箱中干燥至水分含量5%~10%，研磨過60目篩后放入干凈平皿中，在146 ℃烘箱中反應6 h后室溫冷卻，用蒸餾水（洗7次）洗滌，4000 r/min離心5 min。將制得的濕樣品45 ℃干燥，烘干后粉碎過100目篩，得到樣品。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 反應時間對抗性淀粉含量的影響 固定12%交聯劑、0.71 g/mL底物濃度和70 ℃水浴加熱，研究分別反應2、2.5、3、3.5、4 h對抗性淀粉含量的影響。

1.2.2.2 交聯劑濃度對抗性淀粉含量的影響 固定0.71 g/mL底物濃度、70 ℃水浴加熱和反應3 h，研究分別加入8%、10%、12%、14%、16%交聯劑對抗性淀粉含量的影響。

1.2.2.3 底物濃度對抗性淀粉含量的影響 固定12%交聯劑、70 ℃水浴加熱和反應3 h，研究0.57、0.64、0.71、0.79、0.86 g/mL底物濃度對抗性淀粉含量的影響。

1.2.2.4 溫度對抗性淀粉含量的影響 固定12%交聯劑、0.71 g/mL底物濃度和反應3 h，研究分別采取 40、50、60、70、80 ℃水浴加熱對抗性淀粉含量的影響。

1.2.3 響應面中心組合實驗設計 在單因素實驗的基礎上，以交聯劑濃度（A）、底物濃度（B）和反應溫度（C）作變量，利用響應面優化獲得交聯淀粉制備的最佳工藝條件，具體設計見表1。

表1 三因素三水平響應面中心組合實驗設計Table 1 Three-factor three-level response surface center combination experiment design

1.2.4 還原糖含量測定 測定還原糖含量的方法主要參考 3，5-二硝基水楊酸法[15?16]，移取 0.5 mL 樣品于試管中，再加入0.5 mL水楊酸，混勻，沸水浴5 min，立即冷卻至室溫，再加4 mL去離子水，混勻，測540 nm下樣品吸光度，代入葡萄糖標準曲線（y=3.4831x?0.0556）計算得還原糖含量。

1.2.5 玉米抗性淀粉含量測定 參照GONI等[17]的方法，并稍作修改；稱取1.00 g樣品抗性淀粉，溶于20 mL（pH為 6.0）磷酸氫二鈉緩沖溶液，混勻后加入10 μLα-淀粉酶，在 150 r/min 的振動頻率下，將待測樣品溶液置于離心管中并放入90 ℃恒振蕩器中振蕩30 min，隨即在3000 r/min轉速下離心分離10 min，棄除上清；再向樣品溶液中加入20 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH為4.5）后混勻，再移取0.1 mL葡萄糖淀粉酶加入并再次混勻，在60 ℃恒溫水浴振蕩30 min，之后在3000 r/min轉速下離心15 min后棄除上清液，再水洗兩次去上清；再添加20 mL 4 mol/L KOH溶液充分溶解，冰浴振蕩20 min后調pH至6.0~7.0，加入 0.1 mL耐高溫α-淀粉酶，在 85~90 ℃水浴振蕩30 min后立即冷卻至室溫，調pH至4.5，再向該待測液中添加0.1 mL葡萄糖淀粉酶 ，混合均勻后放置在60 ℃恒溫水浴振蕩1 h；取出樣品立即冷卻至室溫后在3000 r/min轉速下離心15 min再進行離心，水洗3次，收集上清液并定容至100 mL，最后測定溶液pH，再用水楊酸法測定還原糖。

1.2.6 理化性質分析

1.2.6.1 透明度 參照郭澤鑌等[18]方法，稍作修改，稱取3種不同的淀粉樣品，加適量蒸餾水配成質量分數為1.0%溶液，90 ℃水浴加熱30 min。在620 nm處用分光光度計測定淀粉糊吸光度，用吸光度表示透明度。

1.2.6.2 凍融穩定性 稱取樣品置于離心管中，配制成5%淀粉乳溶液，95 ℃水浴30 min，取出冷卻至室溫，于?20 ℃ 下冷藏 24 h，室溫溶解，3500 r/min離心20 min，根據沉淀物質量計算析水率[19]。

式中：m1表示淀粉糊質量，g；m2表示沉淀質量，g。

1.2.6.3 溶解度和膨脹度 參照MERAL等[20]方法，取1.0 g樣品加蒸餾水20 mL，沸水浴30 min，冷卻至室溫，4000 r/min，離心15 min，上清液烘干至恒重分別稱取溶出物質量和管中沉淀物質量。

式中：m1表示上清液溶出物質量，g；m2表示離心后沉淀質量，g。

1.2.6.4 持水力 參照馬麗萍等[21]方法，將100 mg淀粉樣品分散于10 mL水中，置于45、55、65、75、85 ℃水浴1 h，冷卻至室溫后，6000 r/min離心15 min，棄掉上清液，稱沉淀質量，計算持水力。

式中：m1表示沉淀質量，g；m2表示樣品質量，g。

1.2.6.5 淀粉顆粒表面形態分析 測試電壓5 kV，噴金后使用電鏡觀察并拍攝顆粒形貌[22]。

1.2.6.6 紅外光譜分析 樣品和溴化鉀按1:100的比例進行壓片，在400~4000 cm?1波段進行掃描[23]。

1.3 數據處理

做3次平行實驗，采用 Origin 8.5作圖、DPS進行顯著性分析(t檢驗)和Design Expert 8.0.6進行響應面優化處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

如圖1a所示，當改性反應的交聯劑濃度為10%時，玉米抗性淀粉的含量達到最大峰值，顯著高于其它點（P<0.05），為47.32%，故選擇本條件做后續響應面優化指標。因為交聯劑的作用使玉米抗性淀粉分子間作用力增強，在此作用下抗性淀粉的含量得到了進一步的提高，促進了反應進行。繼續添加交聯劑，會使濃度變高會進而導致產物取代度提高，隨著取代度的提高, 破損的淀粉顆粒變得越來越多，對抗性淀粉的生成產生了抑制作用[24]。

如圖1b所示，當改性反應的底物濃度為0.71 g/mL時，玉米抗性淀粉的含量達到最大峰值，顯著高于其它點（P<0.05），為44.24%，隨后呈現下降趨勢，故選擇本條件做后續響應面優化指標。底物濃度高或低，抗性淀粉的含量都會相應下降，一方面是因為淀粉糊濃度低，黏度也低，淀粉分子相互分離；另一方面，淀粉糊濃度太高，流動性變差，且水分子進入淀粉的結晶區比較困難，抑制了反應進行[25]。

如圖1c所示，當改性反應的溫度處于70 ℃時，玉米抗性淀粉的含量達到最大峰值，顯著高于其它點（P<0.05），為42.93%，隨后呈現下降趨勢，故選擇本條件做后續響應面優化指標。適宜的反應溫度會使淀粉分子擴散的速度加快進而會提高交聯劑的交聯效率，當反應溫度超越了臨界溫度后，交聯劑與淀粉間的有效碰撞在一定限度上會被削弱，導致交聯度下降，另有一部分淀粉會產生糊化反應，進而會抑制反應進行[26]。

如圖1d所示，當改性反應時間為3.5 h時，玉米抗性淀粉的含量達到最大峰值，為44.44%，顯著高于其它點（P<0.05），隨后呈現下降趨勢，但是顯著性較低，同時從能耗方面考慮，故選擇本條件作為固定的指標。隨著反應的時間延長可以提高淀粉分子與交聯劑的接觸，二者充分接觸后，玉米抗性淀粉的含量會加大；然而時間過長會招致交聯劑分子間彼此發生作用及水分的大批蒸發，導致淀粉糊化進而對抗性淀粉的生成產生了抑制作用[27]。

圖1 不同因素對抗性淀粉含量的影響Fig.1 The effect of different factors on the yield of resistant starch

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面優化結果分析 根據單因素實驗結果分析選擇反應時間（3.5 h）為確定值。再以交聯劑濃度（A）、底物濃度（B）和反應溫度（C）作變量進一步進行響應面分析優化出最優的試驗指標，響應面試驗的結果見表2。

用Design Expert軟件的8.0.6版本對表2中的數據回歸解析,獲得回歸模型是: Y=44.55+6.67A+6.28B?14.69C+2.90AB?4.77AC?4.78BC?9.56A2?17.13B2?4.21C2；通過方差分析對所得的Y方程進行剖析見下表3。

表2 三因素三水平響應面中心組合實驗結果Table 2 The result of three-factor three-level response surface center combination experiment

Y方程模型的P<0.01，說明此模型達到了極顯著水平，失擬項P為0.3393，失擬項的影響不明顯[28]，同時也意味著非試驗因素對本試驗結果的影響不是很大，決定系數R2=0.9877，表明本次建造的模型與實際實驗擬合度很好。因此，能夠運用上述Y方程來描述各變量與抗性淀粉含量之間的關系，進而來測評各變量對玉米抗性淀粉含量影響的顯著性。交互項中，AB、AC和BC項P>0.05，影響程度不顯著，交互項影響均較小。依據表3中的回歸方程的系數，可知影響玉米抗性淀粉的含量因素的順序為C(溫度)>A(交聯劑濃度)>B(底物濃度)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應面分析 根據上述回歸擬合方程，將3個因素中的任意一個因素固定在不變值(即0水平面)，繪制等高線和響應面曲線，得到另外2個因素彼此作用的結果，去研究相關變量之間的相互作用，并獲得最優坐標點。且等高線圖中的橢圓形意味著兩因素彼此交互作用明顯，而圓形則表示兩個因素之間交互作用不是很明顯[29]。

由圖2b、圖2d和圖2f可知，在某一因素作為中心點固定不變時，其余兩因素彼此交互作用都不顯著。

圖2 不同因素對抗性淀粉含量影響的等高線圖和響應面圖Fig.2 Contour plot and response surface plot of the effect of different factors on the yield of resistant starch

2.2.3 驗證實驗 用 Design Expert軟件（V8.0.6）響應面分析知，應用玉米淀粉制備抗性淀粉的最佳改性條件是: 反應時間3.5 h、底物濃度0.71 g/mL、交聯劑濃度11.31%、反應溫度60 ℃。在上述優化條件下，最高的含量可達60.87%。實際操作將條件調整為：反應時間3.5 h、交聯劑濃度11.5%、底物濃度0.71 g/mL、反應溫度60 ℃。之后進行了3次驗證實驗，含量平均值為(60.76%±0.45%)，該值與分析得到的預測值比較貼合, 表明本次實驗運用響應面優化而得到的最佳參數是可靠的。

2.3 理化性質分析

2.3.1 透明度分析 淀粉的糊透明度是食品應用中非常重要的參數，由于淀粉的分子結構中無生色基團，因此以吸光度的值表示淀粉糊的透明度[30]。交聯淀粉的吸光度為1.246，顯著低于其余二者（P<0.05），這可能是由于交聯鍵數目的增加導致淀粉顆粒的致密性和分子量的增加，因為淀粉分子與交聯劑充分反應后，分子之間更加緊密牢固[31]，進而使光線不容易透過淀粉乳，導致吸光度下降，與楊帆[32]和HU[33]等結果相一致。因此本法制取的交聯淀粉更適用在透明度低的飲料中，如高纖維飲料[28]中用來增加飲料的不透明度（圖3）。

圖3 不同淀粉透明度分析Fig.3 Transparency analysis of different starches

2.3.2 凍融穩定性分析 樣品的凍融穩定性是由析水率反映出來的，析水率與凍融穩定性成反比，好的凍融穩定性可以賦予食品良好的膨化度和良好的質地。交聯法制得的抗性淀粉析水率為88.08%，顯著高于酯化淀粉和原淀粉（P<0.05），可能是由于分子間親水力增強，減弱分子間氫鍵強度，減小脫水縮合作用，降低淀粉冷凍后的穩定性[34]（圖4）。

圖4 不同淀粉凍融穩定性分析Fig.4 Analysis of freeze-thaw stability of different starches

2.3.3 溶解度和膨脹度分析 如圖5a可見，普通玉米淀粉經交聯后，溶解度由10.02%提高至13.01%，顯著高于原淀粉（P<0.05）。因為在制備抗性淀粉的過程中它的結晶結構會在加熱條件下被破壞，進而導致直鏈淀粉從結晶結構中解離并且分散于水中，隨著溫度的提高，淀粉分子微晶束也變得松弛，淀粉也會不斷溶解[35]。

圖5 不同淀粉的溶解度和膨脹度分析Fig.5 Solubility and swelling analysis of different starches

而膨脹度是淀粉顆粒完整性的一個指標。如圖5b所示，在沸水浴的條件下，導致原淀粉糊化成淀粉糊的同時大量吸水，由于氫鍵被破壞，與羥基結合的水分子被釋放，顆粒膨脹，因此玉米淀粉的膨脹度急速升高[36]；交聯淀粉的膨脹度408.02%顯著低于原淀粉1009.00%，可能是由于交聯反應增強了淀粉鏈之間的鍵合，從而抑制了淀粉顆粒的溶脹[37]，可以更好的應用于熱加工食品中。

2.3.4 持水力分析 在65 ℃之后原淀粉的持水力顯著高于兩種抗性淀粉（P<0.05），可能是在沸水浴的條件下，高于普通玉米淀粉的糊化溫度，導致原淀粉糊化成淀粉糊的同時大量吸水，因此玉米淀粉的析水率急速升高[37]。在制備抗性淀粉的過程中，檸檬酸與淀粉分子生成檸檬酸酐，而交聯劑與淀粉分子生成磷酸酯基，因此酯化淀粉持水力優于交聯淀粉，本實驗制備出的交聯淀粉持水力較穩定，與牛博文等[38]研究結果相一致，可以更好地適用于食品工業中（圖6）。

圖6 不同淀粉的持水性分析Fig.6 Water holding capacity analysis of different starches

2.3.5 淀粉顆粒表面形態分析 玉米淀粉顆粒表面較為平滑，大小不一，顆粒呈橢球形或者多邊形。發生交聯反應后，淀粉顆粒的形狀和大小沒有顯著差異。結果表明，玉米抗性淀粉交聯后，有輕微的凹陷，淀粉分子變成不規則多面體，分子表面變得不平滑，是由于復合交聯劑與淀粉分子發生化學反應從而腐蝕了淀粉分子表面[39]；檸檬酸酯化后的淀粉原有顆粒形貌顯著被破壞，顆粒表面凹凸不平，說明淀粉分子表面和內部結構因乙酰基的加入而被破壞了顆粒表面[14](圖7)。

圖7 不同淀粉的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron micrographs of different starches

2.3.6 紅外光譜分析 傅里葉紅外光譜儀可以在一定范圍檢測內淀粉分子的結構，尤其是分子鏈之間的構象和雙螺旋結構間的不同[40]。紅外光譜圖中在1200、1086和1026 cm?1附近的吸收峰是C-O鍵的伸縮，3400 cm?1附近的寬峰歸屬于－OH鍵的伸縮振動，在1700 cm?1附近對應的是C=O酯鍵的特征峰[41]。如圖8所示，在1700 cm?1處與玉米淀粉相比酯化淀粉發生了伸縮振動，檸檬酸的確和淀粉發生了酯化反應。在3400 cm?1處的-OH伸縮振動峰與玉米淀粉相比變寬，這說明-OH被交聯鍵取代，伸縮振動減少，隨著交聯反應的進行，交聯淀粉引入的新的磷酸基團和玉米淀粉分子中天然存在的磷酸基團對應的特征峰距離較小，互相重疊，因此峰值的增加是因為引入了磷酸基團引起的，反映出了交聯反應的發生。1022 cm?1和995 cm?1的值可反映出淀粉顆粒雙螺旋結構的程度，從圖8中可以看到，與原料玉米淀粉相比，交聯淀粉和酯化淀粉峰值都有所下降，結合前文電鏡分析，可能是制備抗性淀粉的過程中玉米淀粉原有的結構遭到了破壞，所以峰值與玉米淀粉比較之下相對較小。

圖8 不同淀粉的紅外光譜圖分析Fig.8 Infrared spectrum analysis of different starches

3 結論

優化得到的玉米交聯抗性淀粉的改性條件為：反應時間3.5 h、交聯劑濃度11.50%、底物濃度0.71 g/mL、反應溫度60 ℃。在此最優改性條件下可制出RS含量為60.76%、膨脹度為408.02%、和溶解性為13.01%的交聯淀粉。通過紅外光譜證實了交聯反應的發生，掃描電鏡結果表明交聯淀粉顆粒的形狀和大小與原淀粉對比沒有顯著差異，但是交聯法改性制取的RS凍融穩定性不如原淀粉，有待日后進一步研究。