混料設(shè)計優(yōu)化花生粕制備呈味基料復(fù)合酶配比

張麗霞，孫曉靜，魏松麗，金 璐，麻 琳，孫 強, ，蘆 鑫，趙謀明

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心, 河南鄭州 450002；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東廣州 510640）

花生是我國重要的油料作物之一，主要用于榨油[1?2]，花生粕是榨油后的副產(chǎn)物，蛋白含量可達(dá)55%，是一種大宗蛋白資源[3?4]。然而脫脂工藝后蛋白溶解性變差，口感不佳[5]，限制了花生粕蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用。目前酶解技術(shù)被廣泛使用于食品加工業(yè)，并被認(rèn)為是提高蛋白價值、實現(xiàn)功能多元化的有效途徑之一[6?7]。一些蛋白可通過酶解被水解成小分子肽及游離氨基酸，賦予酶解物一定的滋味[8]。呈味肽是指從食物中提取或由氨基酸合成得到的對食品風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)的分子質(zhì)量低于3000 Da的寡肽類，包括特征滋味肽和風(fēng)味前體肽[9?10]。多項研究已經(jīng)證明，游離氨基酸可直接影響食物的味道。花生蛋白中，酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）含量占總氨基酸的32%[11]，是優(yōu)良呈味基料的生產(chǎn)原料。目前國內(nèi)外關(guān)于花生酶解的研究主要集中在活性肽的制備，如 ACE 抑制肽[12?13]、抗氧化肽等[14?15]，制備呈味基料的研究報道較少，梁蓉等[16]探討了內(nèi)肽酶和端解酶復(fù)合處理制備低苦味花生混合肽的工藝；史秋映[17]采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解法、ZHANG等[18]將發(fā)酵和酶解結(jié)合制備花生呈味肽。但這些研究中均存在水解度低的問題，即使采用雙酶水解，水解度也僅達(dá)到35%。因此，研究出一種酶解效果佳的復(fù)合酶尤為重要。

以花生粕為原料，制備鮮味突出的呈味基料，本研究以水解度、蛋白回收率和滋味評價為指標(biāo)，從木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶中篩選出三種酶，通過混料試驗對其進(jìn)行配方設(shè)計、優(yōu)化，旨在為酶法制備花生呈味基料提供一種高效復(fù)合酶，也為花生粕的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生粕粉（蛋白含量58.87%，以干基計） 實驗室自制，脫紅衣的豫花37號花生仁冷榨去油后的花生粕，粉碎過80目篩備用；木瓜蛋白酶（酶活力1×104U/g）、菠蘿蛋白酶（酶活力 1.5×104U/g）、胰蛋白酶（酶活力1.8×104U/g） 河北百味生物科技有限公司；500 MG風(fēng)味蛋白酶（酶活力2×104U/g）、蛋白酶1.6（復(fù)合蛋白酶，酶活力3×104U/g）、中性蛋白酶（酶活力 3×104U/mL）、堿性蛋白酶（酶活力 2.4×105U/mL） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

P230高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司；Lyovac GT1 冷凍真空干燥機 德國SRK系統(tǒng)技術(shù)有限公司；K-05自動定氮儀 上海晟聲自動化分析儀器有限公司；Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；SHA-B水浴恒溫震蕩器 金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶的篩選 取底物花生粕粉，按料液比1:10（g/mL）加入去離子水混勻，立式蒸汽滅菌鍋中120 ℃預(yù)處理30 min，冷卻至室溫，得到預(yù)處理花生粕水溶液；添加8000 U/g的不同蛋白酶，分別在其最適pH和溫度下恒溫振蕩酶解14 h，沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，5000 r/min離心20 min，取上清液備用。以蛋白回收率、水解度和味感評分為指標(biāo)篩選出三種酶進(jìn)行復(fù)合配比優(yōu)化。同時以未經(jīng)過120 ℃預(yù)處理30 min的花生粕水溶液酶解作為對照組。不同種類蛋白酶水解的最適pH和溫度如表1所示。

表1 不同蛋白酶水解最適pH值和溫度Table 1 The optimum pH and temperature for different protease hydrolysis

1.2.2 混料試驗設(shè)計 以蛋白回收率、水解度和滋味稀釋倍數(shù)為響應(yīng)值，以篩選出的三種蛋白酶占比為自變量，采用Design-Expert 8.0.6軟件中的D-最優(yōu)混料試驗設(shè)計，按照1.2.1的方法制備酶解液，根據(jù)前期預(yù)實驗，固定料液比 1:10（g/mL），加酶量8000 U/g，酶解 pH7.9，酶解溫度 52 ℃，酶解時間14 h，對制備花生呈味肽的復(fù)合酶配比進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 蛋白回收率測定 參考GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的方法，采用凱氏定氮法測定樣品中氮含量。

1.2.4 水解度測定 采用鄰苯二甲醛（OPA）法進(jìn)行蛋白質(zhì)水解度（degree of hydrolysis，DH）定量分析[19]。

式中：h為水解的肽鍵數(shù)； htot為總肽鍵數(shù)，7.49 mmol/g[20]。

1.2.5 滋味評價

1.2.5.1 單一蛋白酶酶解效果評價 感官評價小組由10個經(jīng)感官評價培訓(xùn)的食品專業(yè)人員組成。采用評分法，對苦味、鮮味、咸味、酸味、甜味和綜合風(fēng)味進(jìn)行評價。標(biāo)準(zhǔn)品分別為1%蔗糖、0.05%苦味劑、0.1%檸檬酸、1%氯化鈉和0.5%味精，這些標(biāo)準(zhǔn)品記為5分。將不同蛋白酶的酶解液在10?3kPa真空度下冷凍干燥36 h，配成1%濃度的溶液，與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行打分。評價員對每個樣品進(jìn)行品嘗，每次取約1 mL，在口腔中停留10 s，評價完一個樣品后，評價員需要用純凈水漱口再進(jìn)行下一個樣品的品嘗 (表2)。

表2 不同蛋白酶酶解液滋味評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of different protease hydrolysates

1.2.5.2 復(fù)合酶酶解效果評價 復(fù)合酶法酶解花生粕所得的酶解產(chǎn)物滋味豐富，以鮮味為主，其次為咸味，稍有苦味，為簡化評價步驟，采用滋味稀釋分析法[21?22]（滋味稀釋倍數(shù)）對其進(jìn)行評價。將不同酶解液冷凍干燥，取5 g凍干粉至燒杯中，逐步添加蒸餾水稀釋，終點判斷采用三點試驗法。當(dāng)某個稀釋水平的溶液與2個純凈水之間的滋味差異剛好能被識別出來時，記錄該加水量的毫升數(shù)，用該毫升數(shù)表示為滋味稀釋倍數(shù)[23]。

1.2.6 肽分子量分布 采用凝膠滲透色譜法，取10 mg酶解液凍干粉，加入1 mL去離子水溶解，過0.22 μm濾膜，備用。色譜檢測條件：色譜柱為SEC-125柱，流動相為乙腈:水:三氟乙酸 45:55:0.1（v/v/v），流速為 0.5 mL/min，柱溫 25 ℃，檢測波長220 nm，進(jìn)樣量為 20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics 20對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，差異顯著性分析采用ANOVA，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶的篩選

高溫預(yù)處理是食品工業(yè)中預(yù)處理的常見手段，研究表明，高溫預(yù)處理可改善蛋白的一些功能性質(zhì)，是一種安全高效的蛋白修飾方法[24]。蛋白回收率可反映酶解對原料蛋白的利用率，水解度體現(xiàn)了蛋白的水解程度，兩者可共同表征蛋白酶的水解效果[25]，因此以蛋白回收率和水解度為指標(biāo)，結(jié)合味感評價結(jié)果，對七種蛋白酶進(jìn)行篩選，選擇蛋白回收率、水解度和味感評分高的蛋白酶進(jìn)行復(fù)配（結(jié)果見表3、表4）。

表4 不同蛋白酶酶解液味官評價結(jié)果（分）Table 4 Taste evaluation results of different protease hydrolysates（score）

由表3可知，花生蛋白的酶解效果受蛋白酶種類的影響，且經(jīng)預(yù)處理后花生粕水溶液中蛋白回收率和水解度均有所提高。在最適作用條件下，風(fēng)味蛋白酶組的蛋白回收率和水解度均顯著高于其他蛋白酶（P<0.05），其次是堿性蛋白酶，菠蘿蛋白酶最低；風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶高溫預(yù)處理組的水解度與未高溫處理組相比均有顯著提高（P<0.05），尤其是風(fēng)味蛋白酶預(yù)處理組的蛋白回收率提高了23%，可能是由于風(fēng)味蛋白酶可以通過內(nèi)肽酶和外肽酶的共同作用，更廣泛地水解蛋白質(zhì)分子中的肽鍵[26]。陳林等[27]將花生分離蛋白進(jìn)行加熱預(yù)處理，酶解效果顯著提升。因此，本研究對花生粕水溶液進(jìn)行預(yù)處理后再酶解。

表4中，7種酶解液出現(xiàn)鮮味、苦味和咸味，均未品嘗出酸味和甜味；經(jīng)高溫預(yù)處理所得的酶解液評分均高于對照組。風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶的酶解液以鮮味為主，堿性蛋白酶為苦味，菠蘿蛋白酶由于水解度低未品嘗出基本滋味。綜合味感評分中復(fù)合蛋白酶評分最高，其次是風(fēng)味蛋白酶；中性蛋白酶評分最低，其酶解液產(chǎn)生令人不愉快的滋味。

綜上，風(fēng)味蛋白酶的水解效果最好，復(fù)合蛋白酶酶解液味感評分最高，堿性蛋白酶酶解液雖有一定程度的苦味，但可增加蛋白的水解度；胰蛋白酶的酶解液有呈味效果，但胰蛋白酶的酶解溫度與其它酶相差較大。綜合考慮選擇風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行復(fù)配。

2.2 混料試驗

2.2.1 混料試驗設(shè)計及結(jié)果 采用Design-Expert 8.0.6軟件通過設(shè)置上、下約束條件進(jìn)行混料試驗設(shè)計，本試驗采用最優(yōu)設(shè)計對試驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模型建立和參數(shù)優(yōu)化。

以風(fēng)味蛋白酶（A）占比、堿性蛋白酶（B）占比和復(fù)合蛋白酶（C）占比為自變量，蛋白回收率（Y1）、水解度（Y2）和滋味稀釋倍數(shù)（Y3）為響應(yīng)值，三種酶占比均限定在0.1~0.8范圍內(nèi)，且A+B+C=1（100%），試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表5 混料試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Mixture design and results

2.2.2 混料試驗?zāi)Ｐ徒⒓帮@著性檢驗

2.2.2.1 以蛋白回收率為響應(yīng)值的分析結(jié)果 運用Design-Expert 8.0.6軟件對表6中蛋白回收率的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：Y1=80.38A+77.49B+80.47C+15.28AB+2.47 AC+24.78BC?81.45ABC?45.81AB（A?B）+155.05AC（A?C）?71.23BC（B?C）。

表6 蛋白回收率回歸方程方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equation for protein recovery

蛋白回收率回歸與方差分析結(jié)果見表6，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，回歸模型顯著（P<0.01），失擬項不顯著，決定系數(shù)R2=0.9828，R2Adj=0.9570，說明該模型與試驗擬合良好。

由回歸方程Y1可知，3個一次項和3個二次項的系數(shù)均為正數(shù)，表明該三種酶單一使用以及三種酶交互使用對蛋白回收率均起到促進(jìn)作用，貢獻(xiàn)大小分別為C>A>B和BC>AB>AC。表明單酶中復(fù)合蛋白酶起著重要作用，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶的共同水解作用顯著提高蛋白回收率（P<0.01）。

復(fù)合酶配比對蛋白回收率影響的等高線圖如圖1所示。當(dāng)堿性蛋白酶用量較多，風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶用量較少時，蛋白回收率在75%左右；當(dāng)風(fēng)味蛋白酶或復(fù)合蛋白酶用量較多，其他兩種酶用量較少時，蛋白回收率達(dá)到80%。三種酶在酶解過程中，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶均能起到主導(dǎo)作用，且復(fù)配后對蛋白回收率產(chǎn)生協(xié)同作用。

圖1 蛋白回收率等高線圖Fig.1 Contour map of protein recovery

2.2.2.2 以水解度為響應(yīng)值的分析結(jié)果 運用Design-Expert 8.0.6軟件對表7中水解度的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：Y2=56.60A+45.40B+42.96C+19.18AB+1.90AC?9.57BC+39.96ABC+67.09AB（A?B）?153.46AC（A?C）?21.52BC（B?C）。

水解度回歸與方差分析結(jié)果見表7，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，回歸模型顯著（P<0.01），失擬項不顯著，決定系數(shù)R2=0.9940，R2Adj=0.9850，說明該模型與試驗擬合良好。

表7 水解度回歸方程方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equation for degree of hydrolysis

由回歸方程Y2可知，3個一次項的系數(shù)均為正數(shù)，表明該三種酶單一使用時對水解度均起到促進(jìn)作用，貢獻(xiàn)大小為A>B>C，風(fēng)味蛋白酶起著較為重要的作用；二次項的系數(shù)可以看出，AB和AC交互項對水解度有促進(jìn)作用，風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶共同水解作用顯著提高蛋白水解度（P<0.01）。

復(fù)合酶配比對蛋白水解度影響等高線圖如圖2所示。隨著風(fēng)味蛋白酶添加量的增加，水解度呈上升的趨勢，在添加量約57%時水解度達(dá)到最大值。水解度隨著堿性蛋白酶的增加先升高后降低，研究表明，堿性蛋白酶水解速率較高，在水解初期能快速水解蛋白[28]，但隨著添加量增加，特定水解殘基被水解完全，且含外切酶的風(fēng)味蛋白酶添加量減少，水解度下降。

圖2 水解度等高線圖Fig.2 Contour map of degree of hydrolysis

2.2.2.3 以滋味稀釋倍數(shù)為響應(yīng)值的分析結(jié)果 運用Design-Expert 8.0.6軟件對表8中滋味評價的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：Y3=62.03A +40.58B +39.80C?7.03AB?32.68AC?4.23BC +123.15ABC +46.93AB（A?B）?142.20AC（A?C）?14.11BC（B?C）。

滋味評價回歸與方差分析結(jié)果見表8，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，回歸模型顯著（P<0.01），失擬項不顯著，決定系數(shù)R2=0.9979，R2Adj=0.9948，說明該模型與試驗擬合良好。

表8 滋味評價回歸方程方差分析Table 8 Analysis of variance of regression equation for dilution ratio

由回歸方程Y3可知，3個一次項的系數(shù)均為正數(shù)，表明該三種酶單一使用時對水解度均起到促進(jìn)作用，貢獻(xiàn)大小為A>B>C，風(fēng)味蛋白酶起著較為重要的作用。風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶共同水解作用對滋味評價結(jié)果的提高均明顯（P<0.01），風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的交互作用不顯著。

復(fù)合酶配比對滋味稀釋倍數(shù)影響的等高線圖如圖3所示。將三種酶復(fù)配后，酶解液呈不同程度的鮮咸味。隨著風(fēng)味蛋白酶添加量的增加，滋味評價呈上升趨勢，堿性蛋白酶添加量增加到33%后，對滋味評價結(jié)果呈負(fù)影響，酶解液的鮮咸味主要來源于風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，堿性蛋白酶的酶解液呈苦味，因此，應(yīng)控制堿性蛋白酶的添加量。

圖3 滋味評價等高線圖Fig.3 Contour map of dilution ratio

2.3 最優(yōu)配方確定及驗證試驗

感官評價和營養(yǎng)特征是食品的重要屬性，因此在提高酶解效果的基礎(chǔ)上，考慮味道對食品品質(zhì)的影響。對上述3個指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮，分別賦予水解度重要度為5，滋味評價為3，蛋白回收率為2。經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件統(tǒng)計分析，最終得出酶法制備花生呈味肽的最佳酶配比為風(fēng)味蛋白酶: 堿性蛋白酶:復(fù)合蛋白酶=0.721:0.149:0.129，酶解液蛋白回收率預(yù)測值為83.64%，水解度預(yù)測值為55.15%，滋味評價預(yù)測值為56.13。在優(yōu)化配方下，進(jìn)行3次驗證試驗，酶解液蛋白回收率驗證值為(81.95%±2.69%)，水解度驗證值為 (52.79%±2.04%)，滋味評價驗證值為（53.80±1.67），與預(yù)測值間的標(biāo)準(zhǔn)偏差在合理范圍內(nèi)。驗證試驗證實，模型預(yù)測值與實驗值相符，模型成立。

2.4 酶解呈味基料中肽分子量分布

為了驗證花生粕經(jīng)復(fù)配酶（風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶）酶解產(chǎn)物中肽的生成以及對呈味效果的貢獻(xiàn)，對花生粕粉和酶解產(chǎn)物的肽分子量分布進(jìn)行測定，見表9。

由表9可知，經(jīng)凝膠滲透色譜法測定，花生粕粉中蛋白分子量主要在1000~50000 Da；而酶解液凍干粉中不含大于10000 Da的蛋白組分，酶解產(chǎn)物中分子量小于1000 Da的水解產(chǎn)物占96.84%，且小于180 Da的含量為63.63%，推測花生粕酶解生成小分子肽和游離氨基酸，該呈味基料為短肽與氨基酸的混合物。RHYU等[29]發(fā)現(xiàn)500~1000 Da的肽具有較強的鮮味，APRIYANTONO等[30]研究結(jié)果也表明低于500 Da的肽呈味效果較好。關(guān)于花生粕酶解產(chǎn)物中不同短肽分子的組成以及分別對呈味效果的貢獻(xiàn)大小還需要進(jìn)一步深入研究。

表9 肽分子量分布Table 9 Molecular weight distribution of peptides

3 結(jié)論

以低溫花生餅粕為原料制備鮮味突出的呈味基料，以蛋白回收率、水解度和滋味評價為指標(biāo)，從七種蛋白酶中篩選出風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行復(fù)配。采用混料設(shè)計對上述三種酶配比進(jìn)行優(yōu)化，以蛋白回收率、水解度和滋味稀釋倍數(shù)為指標(biāo)，分別建立回歸模型和交互項分析得到復(fù)配酶最佳配比為風(fēng)味蛋白酶:堿性蛋白酶:復(fù)合蛋白酶=0.721:0.149:0.129，在優(yōu)化的配比下，蛋白回收率、水解度和滋味評價結(jié)果實際值與模型預(yù)測值一致，模型成立。最佳酶配比制備的酶解液產(chǎn)物中分子量小于1000 Da的水解產(chǎn)物占(96.84%±0.83%)，且小于180 Da的含量為(63.63%±2.85%)，這表明該花生餅粕酶解液呈味基料為短肽與氨基酸的混合物。關(guān)于花生粕酶解物呈味基料中肽和氨基酸組成以及對呈味特性貢獻(xiàn)大小、呈味基料的味道組成等還需進(jìn)一步的研究探討，以期為花生餅粕的多元化利用提供新途徑。