基于霉菌酵母測試片和NIR技術快速鑒別霉變煙草最優勢霉菌種類

林 云，歐陽璐斯，賴燕華，潘曉薇，盧嘉健

（廣東中煙工業有限責任公司，技術中心，廣東廣州 510385）

霉菌屬于真菌類微生物，在自然界中分布十分廣泛。煙草作為一種農產品，即使經過高溫烘烤，依然會有霉菌孢子殘留在葉片上。在運輸和儲存過程中，如果遇到適合霉菌生長的溫濕度環境，則很容易出現霉變。霉變會使煙葉結構被破壞，香氣消失，刺激性增大，并產生苦澀、霉臭味，嚴重影響煙葉質量[1]。以往對煙葉霉變的質量控制手段通常為霉菌計數，然而霉菌的種類有很多，并不是所有種類的霉菌都具有較大的危害，因此單純的霉菌計數并不能對煙草的食品安全性做出客觀全面的評估[2]。煙草上常見霉菌分為多個屬種，如黃曲霉、煙曲霉、黑曲霉和桔青霉等，不同的屬種發展成最優勢菌群進行大量增殖后其危害性有所差異[3]。為了能夠更科學、系統的進行煙葉防霉工作，亟需開發快速鑒別煙葉上的最優勢菌群種類的方法。

現有的最優勢霉菌種類鑒別方法有形態學法、代謝產物檢測法和rDNA-ITS序列分析法。葛志文等[4]利用形態學法對稻谷儲藏期間主要優勢霉菌進行分離和鑒定，發現主要優勢霉菌為黃曲霉、黑曲霉、白曲霉、灰綠曲霉和產黃青霉。李志賢等[5]利用HPLC-TOF/MS法對曲霉代謝物中黃曲霉毒素進行檢測，建立了一種霉菌有毒代謝物篩選和分類鑒定的方法。岳曉禹等[6]從玉米中分離出一株優勢腐敗霉菌M13，通過形態特征觀察和rDNA-ITS序列分析，將該菌株鑒定為米曲霉。以上方法都有各自的優點，但也各有不同的缺陷。其中，形態學法存在檢測周期比較長的問題，一般需要7~10 d，鑒定結果易受雜菌干擾。代謝產物檢測法、免疫測定法和rDNAITS序列分析法則都需要復雜的前處理步驟，對實驗人員、試劑、設備和環境的要求也相對較高，且分別存在提取和凈化效果不理想、特異性抗體制備難度大、測序結果比對工作量大等問題[4?18]。

近年來，快速霉菌酵母測試片作為霉菌快速檢測技術，在食品領域得到廣泛應用，其培養時間相對傳統的培養基法大大縮短。但在以往的研究中，快速霉菌酵母測試片普遍用于霉菌和酵母的計數，無法直接鑒別霉菌種類[19]。光譜技術是近年來發展迅速的分析技術之一，其中傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、拉曼光譜（Raman spectra，RS）和傅里葉變換近紅外光譜（Fourier transform near infrared spectroscopy，FTNIR）技術在微生物研究領域取得了一些成果，在食品、制藥等很多行業中有一定的應用[9,20]。現有基于光譜技術的霉菌研究有兩類，一類仍停留在利用近紅外技術預判霉變程度，并沒有深入到菌種鑒別的層面[21?23]；另一類是采集單一種類的干菌粉或孢子懸浮液光譜圖，利用PCA、LDA或PLS-DA等方法建立分類模型[24?26]，該類方法僅能掃描純種菌種進行鑒別，檢測時仍需要進行漫長的菌種分離、凍干菌粉制備等前處理步驟，操作過程繁瑣，應用場景狹窄，實用性較低。

鑒于此，本文首次提出一種霉菌酵母測試片結合NIR技術快速鑒別霉變煙葉上最優勢霉菌種類的方法。將霉變煙葉樣本稀釋液用快速霉菌酵母測試片壓片培養，并運用近紅外光譜法直接對測試片上的菌落及其特征代謝產物進行表征。利用離散小波變換對光譜進行預處理，并利用隨機森林算法從小波系數中識別不同種類最優勢霉菌的特征信息，建立最優勢菌種識別模型，以期為霉變煙草提供優勢霉菌種類的快速鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復烤煙 選取147份不同年份、不同產地、不同等級的復烤煙葉，由廣東中煙工業有限責任公司提供；PetrifilmTM快速霉菌酵母測試片 美國3M公司；全過濾型均質袋 Interscience公司；氯化鈉、乙醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

MPA傅立葉變換近紅外光譜儀 德國Bruker公司；BSA224S-CW電子天平 Sartorious公司；KBF恒溫恒濕箱 Binder公司；BA-2S拍打式無菌均質器 上海本昂科學儀器有限公司；Double Biocao RNA/DNA超凈臺 Erlab公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 霉變煙葉樣品的制備 取復烤煙葉樣品分別放置在溫度（25±2）℃，濕度（80%±5%）的恒溫恒濕箱中進行人工霉變[21]，每份樣品之間互相隔開以免交叉污染。煙葉發霉后，用形態學法[4]進行菌種鑒別，將每份樣品中最優勢霉菌的屬種信息作為建模的基礎數據。

1.2.2 含菌測試片樣本的制備 在無菌環境下，將霉變煙葉放入均質袋中，按1:9的比例加入滅菌生理鹽水，并放在拍打式無菌均質器上拍打1 min，制成10?1的霉變樣品稀釋液。將10?1的霉變樣品稀釋液用滅菌生理鹽水分別稀釋成 10?2、10?3和 10?4濃度，使每份霉變煙葉樣品共獲得四個梯度的稀釋液[4]。用快速霉菌酵母測試片對四個梯度的稀釋液分別進行壓片，于（28±2）℃ 培養 2.5~3 d，如此便能獲得具有不同優勢霉菌種類、不同煙葉成分基底、不同稀釋液濃度信息的含菌測試片樣本。

1.2.3 近紅外光譜掃描 將含菌測試片剪成與近紅外專用樣品杯內徑匹配的圓形，正面朝下平整的放入近紅外專用樣品杯中并壓上壓樣器，然后將樣品杯放置在近紅外光譜儀的旋轉臺上進行光譜掃描。儀器參數為：光譜采集范圍 4000~12000 cm?1，分辨率8 cm?1，掃描次數 64 次。

1.2.4 光譜預處理 由于近紅外光譜儀采集到的數據信號除了待測成分信息外，還包含了高頻隨機噪聲、基線漂移和雜散光等無關信息，因此需要采用數學前處理方法減少系統噪聲。光譜的前處理方法有很多種，如導數（Derivative）、標準正態變量變換（Standard normal variate transform，SNV）、多元散射校正（Multiple scattering correction，MSC）等[27?28]。在進行多方面對比后，本研究最終采用的數據預處理方法為離散小波變換（Discrete wavelet transformation，DWT）。小波變換是一種高效的信號處理方法，其實質是把信號分解成各個不同尺度和位移的小波，具有傅里葉不存在的多分辨率分析特征。該方法在化學計量學中常被用來進行平滑去噪、數據壓縮和基線扣除等計算[29?32]。本研究利用小波變換將傅里葉近紅外光譜數據在頻域內進行多尺度分解，獲得相對應的低頻小波系數及高頻小波系數。其中，低頻小波系數主要顯示信號的近似分量，高頻系數則主要顯示為細節分量和大部分噪聲分量[21,32]。通過在不同尺度上的分解去噪和重構信號，可為建立優勢霉菌種類模型去除干擾信息，提供更加純凈的信號基礎。

1.2.5 建模方法 隨機森林（Random forest，RF）是由Leo Breiman于2001年提出的一種將決策樹和Bootstrap重抽樣方法結合起來的一種分類算法。它用Bagging方法生成有差異的訓練集，并在此基礎上引入隨機選擇屬性。這種“雙隨機”的策略能讓各個子分類器之間形成較大的差異，使其具有優越的分類性能[30?31]。本研究利用RF算法從小波系數中識別不同種類優勢霉菌的特征信息，建立優勢菌種識別模型。RF分類器訓練有兩個參數需要優化，分別為森林中決策樹數量（ntree）和決策樹節點樹數量（mtry），本研究中 ntree采用 500，mtry取總變量數的平方根。

1.3 數據處理

采用Matlab 2015和Microsoft Excel 2007進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 煙草最優勢菌種類

由于一份樣品在一定環境內能給霉菌提供的資源有限，當某一種霉菌大量增殖，便會擠占其他霉菌的生態位，在數量上和作用上都占領最主導的地位，成為最優勢菌。雖然自然界霉菌種類很多，煙草上能夠檢出的霉菌種類也不少，但在一定的溫濕度條件下，煙草上易于發展為最優勢菌的霉菌種類并不多[33]。在本研究的147份霉變煙草樣本中，每份樣本檢出的最優勢霉菌覆蓋了3個屬7個種，其中屬包括曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和毛霉屬（Mucor）。曲霉屬覆蓋了4個種，分別為黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus），青霉屬覆蓋了 2個種，分別為桔青霉（Penicillium citrinum）和產黃青霉（Penicillium Chrysogenum），毛霉屬檢出的是總狀毛霉（Mucor racemosus）。在所有的優勢霉菌樣本中，檢出率最高的為曲霉，其次為青霉，曲霉中又以黃曲霉最常見。

將霉變樣本分別用生理鹽水稀釋成不同的倍數后用測試片進行壓制和培養。選擇霉菌酵母測試片作為霉菌培養和光譜掃描的載體的優勢有以下幾點：一是其基底背景相對單純，使得本方法具有一定的泛用性，不僅限于煙草領域，在其他食品領域的應用也具有較大的可能性。二是菌種在快速霉菌酵母測試片的培養時間比傳統培養基法短，前處理步驟也不包含菌種分離、凍干粉制備等，這能明顯縮短檢測時間。三是菌種在測試片上能夠比干菌粉和孢子懸浮液留下更完整的代謝產物信息，使得最終采集到的光譜信息更加豐富且更具特異性。四是可使霉菌鑒種和計數同步進行，將計數用的測試片直接進行光譜掃描即可預測出最優勢菌種類型。同一個廠商生產的空白霉菌酵母測試片的基底是相同的，不同的壓片由于霉變樣品煙葉化學成分、稀釋液倍數、優勢霉菌種類等各有差異，其呈現出的底色、菌落的大小和密度也不一樣，經肉眼判斷無法直接識別霉菌種類。部分稀釋液由于稀釋倍數高，制得的壓片含菌過少，甚至是不含菌，不適宜用來掃描建模，因此需要將其剔除。試驗最終獲得428份含菌測試片樣本，樣本的具體信息見表1。

表1 樣本最優勢霉菌種類信息Table 1 Information of the most dominant mold in samples

2.2 光譜預處理與模型建立

將428份含菌測試片樣本用傅里葉近紅外光譜儀進行掃描，獲得含有各種信息的傅里葉近紅外光譜數據。由于物質在近紅外譜區的吸收主要是包括CH，N-H，O-H，S-H，C=O，C=C在內的有機分子基團基頻振動的合頻和倍頻振動吸收，而不同最優勢霉菌的細胞、孢子及代謝產物等的化學組分均有各自的特異性，因此不同的最優勢霉菌在近紅外光譜吸收應當有所差異。然而，從圖1可以看出，近紅外光譜吸收峰重疊十分嚴重，多組分復雜樣品的近紅外光譜不是各組分單獨光譜的疊加，單純從譜圖中無法直觀的識別不同最優勢霉菌的差異，因此需要用化學計量學從復雜的光譜中提取有效信息。

本研究利用DWT對傅里葉近紅外光譜數據進行預處理。為了獲得更佳的預處理效果，需要選擇合適的小波基函數和分解層數。和傅里葉變換相比，小波變換有著很多的小波基可選，同一個信號在不同的小波基上進行展現會有不同的分解效果。在實際應用中，通常是根據分解后的最終數據和理論效果之間存在的誤差來判斷小波基的合適度[21,32]。常用的小波 基 函 數 有 Daubechies、Symlets、Coiflets和Biorthogonal等，其中Daubechies小波系簡稱dbN，其具有較好的正則性，隨著小波分解級數的增加，小波函數的消失矩增大，小波更加光滑，在時域的緊支撐性降低，在頻域的局部性增加[32]。本研究將428份光譜數據中約2/3劃分為訓練集，1/3作為測試集，采用不同的 Daubechies小波系（db1，db2，db3，…，db6）和小波分解層數（1~6）對原始光譜進行處理，得到不同的小波系數重構光譜。利用RF從不同的小波系數中識別最優勢霉菌特征信息，基于訓練集構建最優勢霉菌鑒別模型，通過10折交叉驗證方法考察不同光譜預處理條件下訓練集的分類正確率。

圖2為基于不同小波基函數和分解層數所得小波系數的隨機森林訓練結果。從圖2可以看出，當小波基函數為db2，分解層數為3時，模型對訓練集所有樣本的鑒別正確率最高，達到98.25%，遠高于直接用原始光譜建模得到的正確率（78.13%）。小波基函數db2和分解層數3的組合對7種不同的最優勢菌鑒別的正確率分別為：黃曲霉100%，黑曲霉100%，米曲霉90.30%，煙曲霉100%，桔青霉100%，產黃青霉91.64%，總狀毛霉100%，除米曲霉外均高于其他小波系數的鑒別能力，其對黑曲霉、煙曲霉和產黃青霉的鑒別能力尤其突出，明顯優于其他小波系數。當小波基函數為db3，分解層數為3時，模型對米曲霉的鑒別正確率雖略高于db2，但其對訓練集所有樣本的整體鑒別正確率和對其余6種霉菌單獨的鑒別正確率均低于db2。因此，本研究最終確定以優化后的小波變換（小波基函數db2，小波分解層數3）為近紅外光譜預處理方法。

圖2 基于不同小波基函數和分解層數的訓練結果Fig.2 Training results based on different wavelet basis functions and wavelet decomposition layers

2.3 模型的驗證

為了驗證優化后的RF模型分類性能，本研究對測試集樣本進行了預測，預測結果見表2。從表2可以看出，在143個測試集樣本中，僅有1個最優勢菌為產黃青霉的樣本被誤報，總預測正確率達到99.30%。

表2 基于DWT-RF模型測試集預測結果Table 2 Predication results of the test set based on DWT-RF

為了進一步考察最優勢菌種鑒別模型的有效性，從復烤煙倉庫和復烤廠中收集了20個實際中已發霉的復烤煙和初烤煙樣品作為外部預測集進行驗證。將收集到的樣品制成10-1濃度的稀釋液后用測試片進行壓片，在（28±2）℃恒溫恒濕箱內培養3 d后取出，用近紅外光譜儀對含菌測試片進行掃描并用模型進行預測，對比數據由形態學法鑒定。從表3可以看出，最優勢菌種鑒別模型對實際中的20個發霉煙葉樣品的最優勢霉菌種類鑒別結果與形態學結果一致，可見本模型能夠實現對實際發霉樣品的準確鑒別。

表3 外部預測結果對比Table 3 The external prediction results of models

3 結論

本研究以快速霉菌酵母測試片作為載體，結合近紅外光譜技術建立了一種快速鑒別霉變煙草最優勢霉菌種類的方法，能夠在種的水平下精準識別不同的最優勢霉菌。采用DWT對光譜進行預處理（小波基函數為db2，小波分解層數為3），利用RF建立霉變煙草最優勢霉菌種類鑒別模型，訓練集鑒別正確率達98.25%，測試集預測正確率達99.30%，對實際中的20個霉變煙葉樣品的預測結果與形態學鑒定結果一致，證明模型分類性能良好。快速霉菌酵母測試片和近紅外光譜技術的巧妙結合，克服了以往研究中快速霉菌酵母測試片僅能用于微生物計數[19]的功能壁壘，同時省略了以往近紅外鑒別微生物技術中需要進行菌種分離、凍干菌粉制備等繁瑣操作步驟[24?26]。在實際應用中，本方法對實驗人員要求低，只需利用已建立好的模型對測試片的光譜進行預測便能實現霉菌種類的快速鑒別，相較于其他實驗室方法，更適合在生產線上進行推廣，為煙葉原料和成品卷煙在儲存過程中的質量監控提供了新的思路。

不同菌種在不同溫濕度環境中的生長速度不同，未來可調整不同的溫濕度環境以進行人工霉變實驗，從而獲得更多種類的最優勢菌種樣本以擴充模型覆蓋范圍。