豆芽中30種植物生長調節劑和喹諾酮類藥物殘留的快速篩查

黃燕紅，蔣 湘，盤正華，蘇海雁，蔣定之，梁飛燕

（廣西-東盟食品檢驗檢測中心, 廣西南寧 530021）

豆芽又稱芽苗菜，營養全面，脆嫩可口，是老百姓餐桌上常見的蔬菜。但近年來，問題豆芽事件頻發[1?2]，相關部門對豆芽食品安全的關注和監管力度[3?4]也越來越大，在2020年的食品監督抽查及風險篩查中發現豆芽在生產過程中存在非法使用植物生長調節劑和喹諾酮類藥物的現象[5?6]。植物生長調節劑如赤霉素、4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤等，是一類用于調節植物生長發育的低毒農藥，主要用于促進芽的形成、抑制根的生產，進而提高發芽率。恩諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星等喹諾酮類藥物主要用于殺菌消毒及防止根部腐爛，從而延長保質期。而植物生長調節劑和喹諾酮類藥物的濫用，可造成生殖障礙、性早熟、肝損害等[7]，會引起過敏反應或誘導病原體產生耐藥性，進而對人體健康構成潛在威脅[8?9]。

目前，豆芽中植物生長調節劑和喹諾酮類藥物的檢測方法文獻均有報道[7?24]，國家食品藥品監督管理局2017年第24號公告附件BJS 201703[25]采用QuEChERS凈化，高效液相色譜-串聯質譜（HPLCMS/MS）法測定豆芽中11種植物生長調節劑，但是在實際應用時，赤霉素、吲哚丁酸的基質干擾較大，在目標峰附近有一個較大的干擾峰[24]。國家市場監督管理總局2019年第15號公告附件BJS 201909[26]采用HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜-串聯質譜法測定豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中11種喹諾酮類化合物。這些檢測方法均為單個或幾個組分單獨檢測，且前處理繁瑣、耗時長、成本高，不能滿足日常監管及食品安全突發事件中大批量的豆芽樣品檢測所需要的高效快速、多組分同時檢測的要求，因此選擇簡便快速的前處理方法及分析手段對解決同時檢測多組分植物生長調節劑和喹諾酮類藥物殘留尤為重要。

根據相關文獻[7?24,27?33]及日常監管檢測需求，本方法選擇了30種植物生長調節劑和喹諾酮類藥物作為研究對象，使用超高效液相色譜-串聯質譜法分析，在同一個色譜質譜條件下同時測定豆芽中可能添加的30種植物生長調節劑和喹諾酮類藥物，并對市售19批豆芽進行快速篩查。以期滿足日常監管和應對突發事件大批量快速準確檢測的要求，并為食品安全檢驗檢測工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃豆芽、綠豆芽 抽樣于廣西本地市場，共19批，絞碎均質后，?20 ℃冷凍保存，待測；空白樣品來自于實驗室自發豆芽 參照DB65/T 4038-2017豆芽生產技術規范自培，綠豆（黃豆）經過清洗和浸豆（大豆 20~25 ℃清水浸泡 6 h，綠豆先用75~80 ℃燙豆 3 min，冷卻后 20~25 ℃清水浸泡4 h）后進行培育（溫度 20~26 ℃，4 h 噴淋一次），6~7 d后采集豆芽樣品；甲酸、乙腈、乙酸銨 色譜純，德國Merck公司；實驗室用水 為超純水；Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱 (6 cc，500 mg) 、HLB 固相萃取小柱（6 cc，200 mg） Waters公司；QuEChERS凈化管（300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18） Stan Quik公司；標準物質：矮壯素（Chlormequat chloride）、多效唑（Paclobutrazol）、氟醚唑（Tetraconazole）、戊唑醇（Tebuconazole）、西瑪津（Simazine）、烯唑醇（Diniconazole）、吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid）、莠去津（Atrazine）、諾氟沙星（Norfloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、洛美沙星（Lomefloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、氟羅沙星（Fleroxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、雙氟沙星（Difloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、環丙沙星（Ciprofloxacin）、達氟沙星（Danofloxacin）、恩諾沙星（Enrofloxacin）、氟甲喹（Flumequine）、2,4-二氯苯氧乙酸（Sodium 2,4-dichlorophenoxyacetate） 、 4-氟 苯 氧 乙 酸 （4-Fluorophenoxyacetic acid） 、 4-氯 苯 氧 乙 酸 （4-Chlorophenoxyacetic acid） 、 6-芐 基 腺 嘌 呤 （6-Benzylaminopurine）、赤霉素（Gibberellic acid）、氯吡脲（Forchlorfenuron）、噻苯隆（Thidiazuron）、三碘苯甲酸（2,3,5-Triiodobenzoic acid）、異戊烯腺嘌呤（N6-(delta 2-Isopentenyl)-adenine） 純度>98%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

4500 Q-TRAP三重四極桿串聯質譜儀 美國AB公司；Agilent SB-Aq RRHD 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 安捷倫公司；Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（十八烷基鍵合硅膠柱）色譜柱（1.7 μm, 2.1 mm×100 mm） 、 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（1.8 μm, 2.1 mm×100 mm）Waters公司；Thermo Hypersil GOLD色譜柱（1.9 μm, 2.1 mm×100 mm）、高速冷凍離心機Thermo 公司；XSE205DU型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水機 德國Millipore公司；Multi Reax 型全自動振蕩器 Heidolph公司；氮氣發生器 英國PEAK公司；TurboVap多功能全自動樣品濃縮儀瑞典Biotage公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理[16]稱取均質后的試樣2.50 g（精確到0.01 g）置于 50 mL聚丙烯離心管中，精密加入10 mL 90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液，渦旋振蕩10 min后，10000 r/min冷凍離心5 min。取上清液約6 mL，加入到PRiME HLB固相萃取柱內，無需活化，保持一秒一滴，收集流出液，精密吸取4 mL于15 mL離心管中，40℃氮吹至近干，殘留液體用50%乙腈溶液定容至 1.00 mL，渦旋溶解，過0.22 μm濾膜后，待上機測定。

1.2.2 標準溶液的配制

1.2.2.1 標準儲備液 分別稱取30種標準物質適量，用乙腈溶解定容至刻度，配制成質量濃度均為1 mg/mL的標準儲備液，?20 ℃條件下保存，有效期六個月。

1.2.2.2 混合標準使用液 分別吸取1.00 mL標準儲備液置于同一100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，制成 30種混合標準中間液（10 μg/mL）；精密量取30種混合標準中間液0.10、1.00 mL分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，混勻（質量濃度分別為 100、1000 ng/mL），為混合標準使用液 1、2。

1.2.2.3 基質加標標準工作曲線溶液 稱取2.50 g豆芽樣品空白基質，分別加入混合標準使用液1、2按1.2.1方法處理樣品，制成質量濃度分別為2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的基質加標標準工作曲線溶液。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB-Aq RRHD色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A 為0.1% 甲酸水，B 為乙腈；進樣體積：10 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃。梯度洗脫程序：0~0.1 min，5%B；0.1~10 min，5%~90%B；10~12 min，90%~95%B；12~15 min，5%B。

1.2.3.2 質譜條件 采用ESI源，正、負離子同時多反應監測模式（MRM）監測；氣簾氣（CUR）流速35 L/min；離子源溫度（TEM）550 ℃；霧化氣（GS1）流速 55 L/min；輔助加熱氣（GS2）流速 55 L/min；正離子：電噴霧電壓（IS）4500V；射入電壓（EP）10 V；碰撞室出口電壓（CXP）6 V。負離子：電噴霧電壓（IS）-4500 V；射入電壓（EP）-10 V；碰撞室出口電壓（CXP）-14 V。

1.3 數據處理

采用MultiQuant 3.0.2和Excel 2010軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

在正負離子模式下分別對待測化合物標準溶液進行掃描找出母離子，在Q1 Multiple lons模式下優化去簇電壓（DP），調節DP至適當值，使母離子峰明顯顯現；再進行子離子掃描，找出對應的響應強度大的特征離子，選取豐度較高的子離子作為定量和定性離子；在MRM模式優化下優化碰撞能量CE等參數，提取離子流色譜圖中拐點的數值為最優參數。優化后的質譜條件見表1。

表1 30種化合物的質譜參數Table 1 MS spectra parameters of 30 chemical compounds

2.2 色譜柱條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇 本研究分別對 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（ 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm,2.1 mm×100 mm）、Agilent RRHD SB-Aq（1.8 μm,2.1 mm×100 mm）、Thermo Hypersil GOLD（1.9 μm,2.1 mm×100 mm）4種不同型號的色譜柱在相同濃度的標準溶液進行掃描分析，考察其分離效果與保留時間。結果發現：Waters ACQUITY UPLC? BEH C18對矮壯素基本無保留；Waters ACQUITY UPLC HSS T3多效唑峰與雜質峰分不開；Thermo Hypersil GOLD喹諾酮類峰型不夠尖銳；Agilent RRHD SBAq分離效果最好，峰型更尖銳。因此采用Agilent RRHD SB-Aq作為本研究的色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇 在流動相的選擇中，為了使分析物與干擾物達到分離，首先考察乙腈和甲醇，發現采用乙腈作為有機相時，質譜響應優于甲醇，且基線噪音較低，應該與乙腈在質譜中更易離子化有關。在水相選擇時，分別對0.1%乙酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、純水、10 mmol/L乙酸銨水溶液、10 mmol/L甲酸銨水溶液進行考察。結果發現，0.1%乙酸水溶液中赤霉素、4-氯苯氧乙酸、氯吡脲等負離子被抑制；0.1%甲酸水溶液中30種化合物均有較好的分離和響應，峰型比較尖銳；純水中赤霉素峰分裂，喹諾酮類響應較低，且大部分化合物峰型拖尾；10 mmol/L乙酸銨水溶液中諾氟沙星等喹諾酮類化合物峰型變差，響應低，同時也降低了赤霉素、2,4-二氯苯氧乙酸等部分負離子化合物的響應；10 mmol/L甲酸銨水溶液中，恩諾沙星、環丙沙星、6-芐基腺嘌呤等化合物峰型拖尾且分離度降低。因此采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為本次研究的流動相。

2.3 樣品前處理方法的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇 本研究首先對提取溶劑進行優化，由于所分析的化合物均為極性物質，且在酸性條件下比較穩定，本方法以30種植物生長調節劑和喹諾酮類藥物中比較典型或回收率比較差的赤霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、6-芐基腺嘌呤等6種化合物為依據，樣品在相同加標量50 μg/kg的情況下，分別考察含1%乙酸乙腈溶液、含1%甲酸乙腈溶液、90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液、80%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液的提取效果，結果如圖1所示。采用90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液作為提取溶劑時，赤霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、6-芐基腺嘌呤回收率穩定，均為77%以上。

圖1 不同提取溶劑的回收率Fig.1 Recoveries of chemical compounds with different extraction solvents

2.3.2 凈化條件的選擇 本研究通過對QuEChERS凈化管（300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18）、Waters HLB固相萃取小柱和Waters Oasis PRiME HLB固相萃取小柱三種凈化方式進行加標回收比較，結果發現，C18粉末能有效去除豆芽中的雜質，但噻苯隆、諾氟沙星、沙拉沙星的回收率較低，僅達到52%~65%；而使用HLB固相萃取小柱過柱時易堵塞凈化柱，回收率偏低，為 58%~89%，且偏差大；PRiME HLB固相萃取小柱屬于過濾性去除雜質固相小柱，能有效去除樣品溶劑中的磷脂類干擾物，樣品溶劑無需轉換、活化柱子、淋洗等步驟，可大大提高樣品通量，對目標物損失較少，回收率達到75%~113%。而豆芽基質中主要雜質為磷脂類干擾物，本研究比較了未使用PRiME HLB凈化以及使用PRiME HLB凈化（圖2）后的樣品，在母離子質荷比為 431 和子離子質荷比為 184 條件下，對磷脂中的主要成分磷脂酰膽堿進行檢測[34]，結果表明PRiME HLB 固相小柱能有效去除豆芽中的大部分磷脂。采用PRIME HLB前處理過程更快速、高效、靈敏，能滿足豆芽中30種藥物殘留的分析檢測要求，故選用PRIME HLB固相小柱進行凈化。

圖2 使用PRiME HLB凈化與未凈化樣品的磷脂酰膽堿總離子流圖Fig.2 Ion chromatogram of the purified sample using PRiME HLB and the unpurified sample without PRiME HLB

2.3.3 標準工作曲線配制的選擇 根據相關文獻[12,18]，豆芽中植物生長調節劑和喹諾酮類藥物的標準工作曲線為空白基質匹配標準曲線和基質加標標準曲線，本研究分別采用這兩種曲線對30種化合物進行加標回收比較，樣品添加濃度為10 μg/kg，結果如圖3所示。采用空白基質匹配標準曲線計算回收率時，喹諾酮類藥物的回收率只有63%~78%，且相對標準偏差（RSD）差距比較大，為3.6%~13%，而采用基質加標標準曲線計算回收率時，回收率為85%~112%，RSD為1.5%~7.4%，故本研究采用基質加標標準曲線進行定量。

圖3 不同標準曲線的回收率Fig.3 Recoveries of chemical compounds with different standard calibration

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

按1.2.2.3配制的基質加標標準工作曲線溶液，在優化好的色譜質譜條件下進行檢測。外標法定量，以質量濃度為橫坐標（X，μg/L）、峰面積為縱坐標（Y）繪制工作曲線，30種目標化合物在2~500 μg/L的濃度范圍內線性良好，相關系數r均大于0.99，結果見表2。在陰性樣品中添加已知濃度的標準溶液，以3倍信噪比（S/N）計算檢出限（LOD）、10倍信噪比（S/N）計算定量限（LOQ），結果見表2。30種目標化合物的檢出限為 0.04~1.67 μg/kg，定量限為 0.1~5.6 μg/kg。與標準BJS 201703（植物生長調節劑的檢出限為 5 μg/kg，定量限為 10 μg/kg）和標準 BJS 201909（喹諾酮類的檢出限為 5~7.5 μg/kg，定量限為15~22.5 μg/kg）相比，本方法靈敏度更高。

表2 30種化合物線性范圍、相關系數、檢出限、定量限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, LODs and LOQs of 30 chemical compounds

2.5 回收率和精密度

國家食品藥品監督管理總局、農業部、國家衛生和計劃生育委員會(2015年第 11 號)關于豆芽生產過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質的公告，豆芽中不允許檢出 6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、赤霉素等物質，國家食品安全風險監測豆芽中諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星參考值為不得檢出，參考BJS 201703與BJS 201909兩個標準定量限，確定回收加標水平為 10、50、100 μg/kg。

在優化條件下采用陰性豆芽基質進行加標回收率和精密度試驗，添加水平分別為10、50、100 μg/kg，每個水平分別做6組平行試驗，計算回收率和相對標準偏差（RSD）（見圖4、表3）。30種化合物的回收率為74.0%~113.5%，RSD為0.6%~7.7%，符合多組分分析要求。圖5為50 μg/kg添加水平下，豆芽中目標化合物的正、負總離子流圖。

圖4 30種化合物的加標回收率Fig.4 Recoveries of 30 reference compounds

圖5 30種化合物的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatograms of 30 reference compounds

表3 30種化合物的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSD of 30 chemical compounds (n=6)

2.6 實際樣品的測定

采用本方法對19批樣品中30種藥物殘留進行測定。檢出情況如下：4-氯苯氧乙酸鈉3批，6-芐基腺嘌呤1批，諾氟沙星2批，恩諾沙星2批，環丙沙星1批。其中，4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤與豆芽中植物生長調節劑的測定(BJS 201703)方法進行比較，諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星與豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定（BJS 201909）方法進行比較，結果見表4，本方法前處理更簡單，與標準方法測得結果基本一致，相對偏差為2.2%~9.0%，表明本方法數據準確可靠。

表4 本方法與標準方法測定結果比較Table 4 Comparison of the results between this method and standard method

3 結論

本研究采用改進的PRiME HLB固相萃取柱凈化的方法建立了LC-MS/MS同時測定豆芽中30種植物生長調節劑和喹諾酮類藥物殘留的分析方法。本研究方法可以同時分析豆芽中植物生長調節劑和喹諾酮類藥物，前處理簡單快速、節約成本、縮短檢驗周期，將現行的檢驗標準豆芽中植物生長調節劑的測定(BJS 201703)[25]與豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定（BJS 201909）[26]有效整合，填補了標準分類檢測的不足。該方法簡便快速、基質干擾少、靈敏度高、線性范圍廣，能夠滿足豆芽中植物生長調節劑和喹諾酮類藥物殘留的日常檢測需求。