基于離子液體柱前熒光衍生高效液相色譜法測定動物性食品中7種β-受體激動劑

張 楠，錢瀅文，吳麗華，王燕姣，王 璐，馬 燕，洪 霞，熊敏暉,

（1.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅蘭州 730010；2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測有限公司，甘肅蘭州 730010）

β-受體激動劑屬苯乙醇胺類藥物，一般可分為三大類，含取代基的苯胺型（如克倫特羅）、苯酚型（如沙丁胺醇）、苯二酚型（如特布他林），結(jié)構(gòu)式見圖1[1?3]。該類藥物的主要作用是加強(qiáng)心臟收縮、擴(kuò)張骨骼肌血管支氣管平滑肌，用于休克和哮喘的臨床治療[4?5]。β-受體激動劑類藥物常被非法添加到飼料中，可以促進(jìn)動物生長，減少脂肪沉積，提高瘦肉率，但長期使用會在動物組織中富集，人類食用后會產(chǎn)生很嚴(yán)重的毒副作用，從而危害人類健康[6?8]。歐美等發(fā)達(dá)國家已嚴(yán)禁在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用[9]，我國原農(nóng)業(yè)部176號、1519號公告中明確規(guī)定嚴(yán)禁在動物飼養(yǎng)過程中使用該類藥物，并將β-受體激動劑類列為動物源性食品中殘留的重點(diǎn)監(jiān)控藥物[10?11]。

圖1 β-受體激動劑類結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of β-agonists

目前對β-受體激動劑的檢測方法有免疫法[12?14]、電化學(xué)傳感器法[15?16]、高效液相色譜法[17?18]、質(zhì)譜法[19?22]等。其中，免疫法檢測速度快，但易出現(xiàn)假陽性，穩(wěn)定性和靈敏性有待提高，僅作為初篩方法，適用于大批量樣品的快速篩查[3]。電化學(xué)傳感器法目前還不夠完善，在實(shí)際檢測工作中應(yīng)用較少，需進(jìn)一步研究[23]。質(zhì)譜法靈敏度高，重復(fù)性好，假陽性低，但儀器昂貴，過程較繁瑣，前處理步驟復(fù)雜[24]。高效液相色譜是常見檢測β-受體激動劑的方法，但由于受基質(zhì)干擾，導(dǎo)致檢測靈敏度降低，需要對樣品進(jìn)行提純或富集預(yù)處理[25]。離子液體因不易揮發(fā)、溫度范圍廣、對有機(jī)物無機(jī)物溶解性好、陰陽離子的組合可設(shè)計(jì)性等獨(dú)特的優(yōu)勢而得到廣泛應(yīng)用，尤其在樣品前處理中起到提純和富集目標(biāo)檢測物的作用，達(dá)到減少基質(zhì)干擾和提高檢測靈敏度的目的，從而成為研究的熱點(diǎn)[26]。陳惠芳等[27]采用綠色環(huán)保的離子液體1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和雙三氟甲烷磺酰亞胺鋰，超聲原位合成了1-己基-3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽，應(yīng)用于萃取富集樣品中的硫酸沙丁胺醇和鹽酸萊克多巴胺，建立了離子液體液液微萃取-高效液相色譜分析飼料、動物內(nèi)臟和肌肉中的硫酸沙丁胺醇和鹽酸萊克多巴胺的方法，該方法具有簡便快捷、萃取效果好和試驗(yàn)儀器簡單的優(yōu)點(diǎn)。

本研究在已有研究的基礎(chǔ)上[28?31]，利用實(shí)驗(yàn)室合成的熒光衍生劑離子液體2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑[30]和動物性食品中β-受體激動劑發(fā)生反應(yīng)，極大提高了β-受體激動劑檢測靈敏度，以期達(dá)到簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯化鈉和碳酸鈉 分析純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；正己烷、乙腈和甲醇 色譜純，北京百靈威科技有限公司；鹽酸和乙酸銨 色譜純，西隴科技股份有限公司；克倫特羅（97.5%）、萊克多巴胺（99.0%）、沙丁胺醇（98.7%）、西馬特羅（99.0%）、苯乙醇胺 A（99.6%）、特布他林（98.0%）、福莫特羅（96.0%） 德國 Dr.Ehrenstorfer公司；鄰苯二胺、苯甲酰氯、氯磺酸、丹磺酰氯 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸鹽 本實(shí)驗(yàn)室合成；牛肉、羊肉和豬肉 隨機(jī)購于市場及超市。

20A型液相色譜儀（熒光檢測器） 日本島津科技有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；RX-II型離心機(jī) 天美中國科學(xué)儀器有限公司；JJ500電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光衍生劑合成 熒光衍生劑2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑合成過程詳見本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文章[30]，其合成路線見圖2。

圖2 熒光衍生劑合成路線圖Fig.2 Synthesis route of fluorescent derivatizer

1.2.2 樣品處理 稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，加入25 mL樣品提取液（甲醇：0.2 mol/L鹽酸：20 g/L氯化鈉的體積比為1:1:1），渦旋混勻后超聲提取2 min，于8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，使用5 mL提取液重復(fù)提取（甲醇：0.2 mol/L鹽酸：20 g/L氯化鈉的體積比為1:1:1），合并上清液至雞心瓶中，50℃濃縮至小于5 mL，加入10 mL正己烷，渦旋混勻，靜置分層后棄去上層正己烷，下層用蒸餾水定容至5 mL，待用[27]。

1.2.3 衍生反應(yīng) 準(zhǔn)確吸取1 mL 1.2.2處理的樣液于具塞試管中，加入 1 mL衍生緩沖液（pH10.0，0.1 mol/L碳酸鈉溶液），1 mL衍生劑2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑溶液（2.0 mg/mL溶于丙酮），混勻后加塞，在避光的條件下85 ℃反應(yīng)9 min，冷卻后加入0.05 mL濃鹽酸混勻，過0.45 μm的濾膜，待測。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取七種β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)品100 μg于100 mL容量瓶，甲醇定容配制成濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別吸取 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mL于 10.0 mL 容量瓶，甲醇定容得 1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 ng/mL 7種β-受體激動劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取1 mL按1.2.3進(jìn)行衍生處理后，待測。

1.2.5 色譜條件 色譜柱：C18（4.6×250 mm）分析柱；流動相：pH3.5 的乙酸銨緩沖液（v）+乙腈（v）=40+60；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；激發(fā)波長：365 nm，發(fā)射波長：405 nm。

1.2.6 碳酸鹽緩沖溶液pH優(yōu)化 本試驗(yàn)為了研究不同pH對衍生劑2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑與7種β-受體激動劑反應(yīng)的影響，配制pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的碳酸鹽緩沖溶液。不同pH條件下在豬肉中加標(biāo)10.0 ng/mL 7種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照 1.2.2和1.2.3步驟進(jìn)行處理。

1.2.7 衍生反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間優(yōu)化 在豬肉中加標(biāo) 10.0 ng/mL 7種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照 1.2.2和 1.2.3步驟，在不同溫度 75、80、85、90、95 ℃ 條件下，分別反應(yīng) 3、6、9、12、15 min。

1.2.8 2 -（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑濃度優(yōu)化 分別配制濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL熒光衍生劑2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑。在豬肉中加標(biāo) 10.0 ng/mL 7種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.2和1.2.3步驟，不同濃度熒光衍生劑2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑分別與10 ng/mL 7種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生反應(yīng)。

1.2.9 熒光強(qiáng)度對比 按照步驟1.2.3分別利用2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑和丹磺酰氯衍生含有1.0 μg/kg萊克多巴胺的陽性樣品，對比衍生產(chǎn)物熒光強(qiáng)度，以色譜峰面積大小評價熒光強(qiáng)度大小。

1.2.10 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 對陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。按照1.2.2處理樣品，各加入1.0 μg/mL的七種β-受體激動劑儲備液 5、50、250 μL，得到低、中、高三個不同濃度 1.0、10.0、50.0 μg/kg加標(biāo)水平的陽性樣品，不同基質(zhì)和不同加標(biāo)水平的陽性樣品各制備5份，依據(jù)1.2.3衍生，1.2.5測定，計(jì)算平均回收率、日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.11 實(shí)樣分析 利用1.2.2和1.2.3步驟處理，對市場購買的10份豬肉、10份羊肉和10份牛肉樣品進(jìn)行定性定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行計(jì)算分析，圖采用ChemDraw和Origin 8.5軟件進(jìn)行繪制分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳酸鹽緩沖溶液pH對衍生反應(yīng)的影響

由圖3結(jié)果可知，隨著pH的增加，7種β-受體激動劑峰面積先增加后減小，當(dāng)pH為10.0時峰面積最大，說明衍生劑2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑可以快速有效的進(jìn)攻β-受體激動劑中的仲胺基團(tuán)，生成唯一產(chǎn)物，便于分析檢測。當(dāng)pH為酸性時，不利于衍生反應(yīng)的進(jìn)行；當(dāng)pH為弱堿性時，衍生反應(yīng)速度慢，前處理比較費(fèi)時；當(dāng)pH>10.0時由于堿性過強(qiáng)，衍生劑2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑會與目標(biāo)物中仲胺基以外的基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致目標(biāo)物含量減少，副產(chǎn)物含量增加，不利于分析檢測[30]。故本實(shí)驗(yàn)選擇pH10.0為最佳碳酸鹽緩沖溶液條件。

圖3 pH對7種β-受體激動劑衍生反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of pH on the derivative reaction of 7 β-agonists

2.2 溫度和時間對衍生反應(yīng)的影響

由于常溫條件下，該衍生反應(yīng)耗時較長，故對本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行加熱處理，選擇合理的反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間，從而減少前處理時間。由圖4可知，隨著溫度和時間的增加，7種β-受體激動劑峰面積隨之增加，當(dāng)溫度升至85 ℃，反應(yīng)9 min時，峰面積基本達(dá)到最大，之后隨溫度和時間的增加，峰面積增加不明顯。說明在溫度85 ℃，反應(yīng)9 min條件下衍生反應(yīng)基本能反應(yīng)完全，故本實(shí)驗(yàn)選擇85 ℃環(huán)境中反應(yīng)9 min為最佳衍生條件。

圖4 溫度和時間對7種β-受體激動劑衍生反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of temperature and time on the derivative reaction of 7 β-agonists

2.3 2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑濃度對衍生反應(yīng)的影響

由圖5可知，隨衍生劑濃度的增加，衍生產(chǎn)物的峰面積也相應(yīng)增加，當(dāng)衍生劑濃度達(dá)到2.0 mg/mL后，衍生產(chǎn)物峰面積基本不再增加，說明當(dāng)衍生劑濃度達(dá)到2.0 mg/mL時，能夠保證衍生反應(yīng)的完全進(jìn)行，且衍生產(chǎn)物峰面積并不隨衍生液濃度而增加，故本實(shí)驗(yàn)選擇2.0 mg/mL為最佳衍生劑濃度。

圖5 熒光衍生劑濃度對7種β-受體激動劑衍生反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of fluorescence derivatizer concentration on the derivative reaction of 7 β-agonists

2.4 熒光強(qiáng)度對比

2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑?yàn)楸讲⒑s環(huán)，丹磺酰氯為萘環(huán)，無給電子基團(tuán)，對衍生產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度增加作用不明顯。而2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑結(jié)構(gòu)中有氨基為給電子基團(tuán)，能使得雜環(huán)的電子共軛區(qū)域增大，大幅增加衍生產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，在液相色譜中得到更強(qiáng)的熒光信號，從而有利于提高方法的靈敏度，更適用于痕量檢測工作中。由表1可知，2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑衍生產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度是丹磺酰氯衍生產(chǎn)物的1.82倍。

表1 兩種衍生劑熒光強(qiáng)度比較Table 1 Comparison of fluorescence intensity of two derivatives

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

按照1.2.4步驟配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下測定，7種β-受體激動劑的熒光衍生產(chǎn)物分離度良好，且由于衍生的原因，選擇性的減少基質(zhì)雜質(zhì)峰對目標(biāo)峰的影響。以濃度為橫坐標(biāo)和峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。由表2可知，7種β-受體激動劑在1.0~100 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.999。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限，得到7種β-受體激動劑檢出限約為 0.30 μg/kg，以 10 倍信噪比（S/N）得到 7 種β-受體激動劑定量限<1.0 μg/kg。

表2 7種β-受體激動劑線性方程、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, detection limits and quantification limits of 7 β-agonists

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

結(jié)果由表3可知，7種β-受體激動劑在豬肉、羊肉和牛肉中回收率分別為81.3%~107.3%、80.5%~110.7%和80.2%~105.1%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.48%~13.51%、1.26%~12.33%和1.23%~11.49%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.21%~11.54%、1.82%~13.31%和1.07%~13.21%，說明了本研究的方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可以滿足動物性食品中7種β-受體激動劑殘留的日常檢測要求。

表3 豬肉、羊肉、牛肉中7種β-受體激動劑的平均回收率和日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Average recoveries, intra-RSD and inter-RSD of 7 β-agonists in pork, mutton and beef

2.7 實(shí)樣檢測

本方法應(yīng)用于市場購買的10份豬肉、10份羊肉和10份牛肉中7種β-受體激動劑的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30份樣品中均未檢測到7種β-受體激動劑。

3 結(jié)論

在動物性食品前處理過程中應(yīng)用熒光衍生劑2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑和7種β-受體激動劑反應(yīng)，產(chǎn)物具有熒光強(qiáng)度高和熒光性能穩(wěn)定的特點(diǎn)，建立了高效液相色譜-熒光檢測器檢測動物性食品中7種β-受體激動劑的方法。優(yōu)化了反應(yīng)最優(yōu)條件為碳酸鹽緩沖液pH為10.0、85 ℃溫度下反應(yīng)9 min、2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑的濃度2.0 mg/mL。方法的線性范圍為1.0~100 ng/mL，相關(guān)系數(shù)為R2>0.999，檢出限約為 0.30 μg/kg，定量限為<1.0 μg/kg。該方法熒光衍生劑能高效快速地與β-受體激動劑中仲胺基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，副產(chǎn)物少，最大程度提高衍生產(chǎn)物熒光強(qiáng)度，提高檢測靈敏度，精密度和準(zhǔn)確度高。且該檢測方法前處理簡單易操作，無需固相萃取操作，適用于豬肉、牛肉和羊肉中β-受體激動劑殘留的批量檢測。