高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測黑巧克力中的五種大麻酚

于聰聰，蘭 韜, ，云振宇，初 僑，席興軍，孫冬梅，孟玲玲，張維冰

（1.中國標準化研究院農(nóng)業(yè)食品標準化研究所，北京 100191；2.華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237）

隨著大麻的使用在許多國家已經(jīng)合法化[1?2]，許多大麻食品應運而生。根據(jù)美國一項針對可食用大麻產(chǎn)品標簽使用情況的調(diào)查顯示[3]，常見的食用大麻產(chǎn)品主要包括烘培食品、飲料、糖果及巧克力等[4]。而隨著我國進出口貿(mào)易的逐年增加，一些摻雜了大麻的巧克力也進入國內(nèi)，這類食品容易危害未成年人健康，所以我國也加大了此類食品的監(jiān)管，海關也在著手開展相關食品品類中大麻酚類物質(zhì)的檢測方法規(guī)范起草工作。

文獻資料顯示[5?6]，大麻酚類物質(zhì)結(jié)構相似，如表1所示。這些分子構型差異較小，如大麻二酚（CBD）、大麻酚（CBN）與四氫大麻酚（THC）互為同分異構體，大麻酚類物質(zhì)之間具有緊密的關聯(lián)性，并且在一定條件下還可以相互轉(zhuǎn)化，如四氫大麻酚酸（THCA）在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為THC和CBN[7]，這也導致此類物質(zhì)在分離檢測時較為困難。

表1 常見大麻酚類物質(zhì)基本信息Table 1 Essential information of common cannabinoids

文獻報道[8]，目前檢測大麻酚類物質(zhì)的方法主要包括氣相色譜法[9]（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10?12]（GC-MS）、高效液相色譜法[13?16]（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17?20]（HPLC-MS）等。在這些檢測方法中，氣相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法主要針對易揮發(fā)類物質(zhì)的檢測；高效液相色譜法具有較好的普適性，但檢測物質(zhì)的靈敏度較低；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則具有較高的選擇性、靈敏度及準確度，更適用于基質(zhì)中痕量的大麻酚類物質(zhì)的檢測及定量分析。

目前國內(nèi)大麻酚類物質(zhì)的檢測方法標準主要有公安行業(yè)標準[21]及司法鑒定規(guī)范[22]，這些標準主要針對THC、CBD、CBN三種物質(zhì)，樣品基質(zhì)為人體的毛發(fā)[23]、血液[24]、尿液[25]，大麻植株[26]，火麻油[27?28]，化妝品[29]以及藥品[30]等基質(zhì)中大麻酚類物質(zhì)的檢測方法研究也較多，但是涉及巧克力基質(zhì)的方法較少。目前，美國分析化學協(xié)會（AOAC）在征集巧克力中大麻酚類物質(zhì)的檢測方法[31]，該方法要求目標檢測物必須包含THC、CBD、CBN、THCA、大麻二酚酸（CBDA）這五種物質(zhì)，說明巧克力中此五種大麻酚的同時檢測是非常有必要的。

結(jié)合我國國情，為了滿足進出口檢驗的需要，建立一種兼顧普適性、分辨率、準確度的巧克力樣品中五種大麻酚類物質(zhì)的分析方法是非常有必要的。本文通過優(yōu)化前處理條件和色譜、質(zhì)譜條件，基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立一種同時檢測黑巧克力中五種大麻酚類物質(zhì)的分析方法，并通過方法學驗證，實現(xiàn)檢測方法的標準化，為相關產(chǎn)品的安全監(jiān)管奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CBDA、CBD、CBN、THC、THCA標準溶液1000 μg/mL 美國 Cerilliant公司；甲醇、乙腈 色譜純，德國Merck公司；甲酸 色譜級，國藥集團化學試劑有限公司；黑巧克力 北京物美超市。

ACCELA高效液相色譜儀、TSQQuantum Access MAX三重四極桿質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm I.D.,5.0 μm） 安捷倫科技有限公司；Supersil-ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil ODS-B色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm） 大連依利特分析儀器有限公司；Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）、Hplcone-3C18色譜柱（4.6 mm×150 mm I.D., 2.0 μm） 蘇州麥克旺志生物技術有限公司；VM200型渦旋振蕩器 托摩根生物科技有限公司；HITACHI-CF15RXII離心機 日立公司；JA5003B電子天平（精確至0.01 g） 上海越平科學儀器制造有限公司；電子恒溫不銹鋼水浴鍋上海虞龍儀器設備有限公司；ELGA純水儀 威立雅水處理技術（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 將黑巧克力放置在冰箱?18 ℃保存24 h，取黑巧克力200 g，用小刀將其刮成巧克力屑，放入冰箱?18 ℃ 保存。據(jù)文獻報道[27?28]，采用甲醇經(jīng)過簡單的超聲提取就能夠?qū)崿F(xiàn)大麻酚類物質(zhì)的提取實驗，因此本實驗采用如下步驟進行巧克力樣品的前處理實驗。

準確稱取黑巧克力屑0.5 g于10 mL的離心管內(nèi)，蓋好離心管蓋，在恒溫水浴鍋45 ℃下加熱5 min，使巧克力融化，然后加入2.5 mL的甲醇，渦旋震蕩2 min，再用離心機在1000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，最后過0.22 μm的濾膜，上機。

1.2.2 檢測條件 三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI），采用正離子掃描模式（ESI+）和負離子掃描模式（ESI-），霧化氣為液氮；掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM）；毛細管溫度為350 ℃；霧化氣溫度為300 ℃；鞘氣壓力為35 Arb；輔助氣壓力為5 Arb；離子噴霧電壓為3500 V；CID壓力為1.5 Torr。

高效液相色譜儀，色譜柱：Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；柱溫：30 ℃；流動相A：0.1%甲酸水（V/V）溶液，流動相B：乙腈；進樣量：5 μL；流速：1800 μL/min；梯度洗脫程序：0~15 min，70%~95%B；15~15.1 min，95%~70%B；15.1~18 min，70%~70%B。

1.3 方法優(yōu)化及驗證

1.3.1 方法優(yōu)化 實驗分別對質(zhì)譜部分和液相部分的實驗條件進行了優(yōu)化，質(zhì)譜部分主要采用蠕動泵直接進樣，對各個待測物的子母離子對及其碰撞能等參數(shù)分別進行優(yōu)化，得出最佳的質(zhì)譜條件；液相部分分別采用不同廠家的色譜柱以及不同洗脫程序進行實驗優(yōu)化，得出最佳的液相條件；實驗還采用甲醇、乙腈等不同的提取溶劑對巧克力樣品前處理等過程進行了優(yōu)化。

1.3.2 線性范圍、檢出限及定量限 混和標準儲備液：分別準確吸取 1 mL 的 CBDA（1000 μg/mL）、CBD（1000 μg/mL） 、 CBN（1000 μg/mL） 、 THC（1000 μg/mL）、THCA（1000 μg/mL）標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成100 μg/mL的五種大麻酚混和標準儲備液，?18 ℃冰箱冷藏保存，有效期為3個月。

標準工作溶液：準確吸取0.1 mL的100 μg/mL的混合標準儲備液，用甲醇稀釋到1 mL，得到10 μg/mL的標準中間液，分別取適量的標準中間液稀 釋 得 到 0.05、 0.10、 0.25、 0.50、 1.00、 2.50、5.00 μg/mL的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

在優(yōu)化的實驗條件下，對7個不同濃度點的標準工作液進行液相色譜-質(zhì)譜分析，以五種化合物的濃度為橫坐標，峰面積響應值為縱坐標，繪制五種大麻酚的標準曲線，然后得出五種大麻酚的線性范圍及線性回歸方程。將添加有大麻酚標準溶液的巧克力樣品按照方法前處理進行提取實驗，并進行液相色譜-質(zhì)譜測定，以目標組分最低水平的3倍平均信噪比為檢出限（LOD），10倍平均信噪比為定量限（LOQ），計算得本方法的LOD和LOQ。

1.3.3 精密度和穩(wěn)定性實驗 實驗對方法的日內(nèi)和日間精密度進行了檢測。在相同儀器條件下，實驗分別以添加標準溶液的巧克力為樣品，按照實驗過程進行前處理實驗，并進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析，計算樣品中五種大麻酚的含量，同時計算其相對標準偏差。日內(nèi)精密度：即在每 d的 8、10、12、14、16、18時分別對樣品進行測定，計算其相對標準偏差，記為日內(nèi)精密度；日間精密度：連續(xù)3 d對巧克力樣品在每d的10時進行測定，并計算其相對標準偏差，記為日間精密度。最終，以日內(nèi)和日間精密度對方法的精密度和穩(wěn)定性進行評價。

1.3.4 方法的準確性 為驗證方法的準確性，實驗根據(jù)計算得到方法的定量限0.15 mg/kg以及標曲的濃度點，實驗采用6個平行樣品，分別取定量限的8.3、16.7和33.3倍對巧克力樣品進行加標回收實驗，其對應的三個加標水平即為1.25、2.50、5.00 mg/kg，且對應標曲中間的三個濃度點0.25、0.50、1.00 μg/mL，然后計算三個加標水平下的回收率及其相對標準偏差，確定該方法的準確性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗采用Excel數(shù)據(jù)處理軟件和Origin數(shù)據(jù)作圖軟件分別對實驗數(shù)據(jù)進行分析和處理。實驗中三個加標水平的回收率實驗采用6個平行樣平行測定6次，采用Excel計算平均值及其相對標準偏差，得到回收率實驗結(jié)果。日內(nèi)精密度采用6個平行樣平行測定6次，采用Excel計算日內(nèi)精密度；日間精密度連續(xù)3 d采用6個平行樣平行測定6次，采用Excel計算3 d的日間精密度。色譜圖均由Origin作圖軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

調(diào)整儀器狀態(tài)，實驗采用蠕動泵直接進樣的方式進行優(yōu)化，配制濃度為1 μg/mL的五種大麻酚的單標溶液，經(jīng)蠕動泵注入質(zhì)譜儀中，分別在正離子掃描模式和負離子掃描模式下對目標物進行全掃，選擇響應強度高的離子掃描模式，再進行二級質(zhì)譜掃描，取目標物的三對或多對離子對，通過系統(tǒng)自動優(yōu)化得到目標物的碰撞能和套管透鏡電壓，優(yōu)化之后五種大麻酚的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 五種大麻酚的質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果Table 2 MRM parameters and MS condition for five cannabinoids

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱優(yōu)化 實驗在相同的流動相及洗脫梯度下，采用五種色譜柱 Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil-ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil ODS-B 色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）、Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）和 Hplcone-3C18色譜柱（4.6 mm×150 mm I.D., 2.0 μm），分別對相同濃度的五種大麻酚混合標準溶液進行分離分析，其HPLC-MS/MS的總離子色譜圖（Total ion chromatogram，TIC）對比見圖1。

從圖1可以看出，五種色譜柱均能完成五種大麻酚的分離，且工作站給出五種物質(zhì)峰的分離度結(jié)果均大于1。其中Zorbax SB-C18對五種大麻酚的分離效果較好，能夠達到完全分離的狀態(tài)，目標物響應強度值較高，峰型也較好，五種大麻酚能夠在12 min內(nèi)全部流出；采用Supersil ODS2色譜柱，五種大麻酚能夠達到完全分離的狀態(tài)，目標物響應強度值最高，峰型也較好，但五種大麻酚完全流出時間長達17 min；采用Supersil ODS-B色譜柱，五種大麻酚能夠達到完全分離的狀態(tài)，五種大麻酚的響應強度值較高，但THCA峰峰型較差，出現(xiàn)拖尾情況，五種大麻酚完全流出時間也較長，達到16 min；采用Cosmosil 5C18-MS-II色譜柱，五種大麻酚能夠達到完全分離的狀態(tài)，但CBDA和CBD的響應強度值差別較大且保留時間比較接近，峰型較好，五種大麻酚完全流出時間為14 min；采用Hplcone-3C18色譜柱，五種大麻酚能夠達到完全分離的狀態(tài)，目標物響應強度值較高，峰型較好，但五種大麻酚完全流出時間較長，為17 min。

圖1 五種不同色譜柱對五種大麻酚分離TIC譜圖的對比Fig.1 The comparison of the TIC chromatograms of five cannabinoids by five kinds of reversed-phase C18 columns

通過對比五種色譜柱下五種大麻酚的響應強度、保留時間及色譜峰峰型發(fā)現(xiàn)，安捷倫Zorbax SBC18色譜柱對五種大麻酚分離的響應強度值較高，峰型較好，且保留時間最短，對五種大麻酚的分離效果最佳，因此最終選擇Zorbax SB-C18進行后續(xù)的實驗研究及方法驗證。

2.2.2 洗脫模式優(yōu)化 實驗分別采用梯度洗脫程序和等度洗脫程序分別對五種大麻酚進行了實驗條件優(yōu)化，兩種洗脫模式下的TIC對比見圖2。通過對比發(fā)現(xiàn)，兩種洗脫模式下五種大麻酚均能分離開，梯度洗脫模式下，五種大麻酚的峰寬較窄且較尖銳，峰型較好；等度洗脫模式下CBN、THC、THCA的峰寬較寬，且響應強度較低，保留時間較長。因此，最終選擇梯度洗脫模式進行后續(xù)的實驗研究及方法驗證。

圖2 不同洗脫程序下五種大麻酚分離的TIC對比圖Fig.2 The comparison of the TIC chromatograms of five cannabinoids based on different separations

2.3 樣品前處理優(yōu)化

實驗采用不同的提取溶劑甲醇和乙腈，以5.00 mg/kg的添加水平進行加標實驗，以五種大麻酚的回收率結(jié)果為指標，考察了不同提取溶劑對巧克力樣品中五種大麻酚的提取效率并對其進行了優(yōu)化，結(jié)果見表3。由表中的數(shù)據(jù)可得，當分別采用甲醇和乙腈作為提取溶劑時，五種大麻酚的加標回收率都在90.6%~96.3%范圍內(nèi)，均能滿足實驗要求，同時考慮到實驗的經(jīng)濟成本，甲醇成本較低，且兩種溶劑對巧克力中五種大麻酚均具有較好的提取效果，因此實驗最終選擇甲醇作為五種大麻酚的提取溶劑。同時，考察了提取溶劑的最佳使用體積，向每份巧克力樣品中添加250 μL的10 μg/mL標準溶液，分別采用2.5 mL和5.0 mL的甲醇進行提取實驗，對兩種情況下五種大麻酚的回收率結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)五種大麻酚的回收率結(jié)果均較好且相當，都在89%~101.8%范圍內(nèi)，說明兩種情況下均能夠?qū)⑶煽肆悠分械奈宸N大麻酚提取完全，考慮實驗的試劑成本問題，最終選擇2.5 mL甲醇作為提取溶劑。

表3 不同溶劑對五種大麻酚提取效率的影響Table 3 Effects of different solvents on the extraction efficiency of five cannabinoids

2.4 方法驗證

2.4.1 標準曲線的線性范圍、檢出限和定量限 根據(jù)五種大麻酚7個濃度點對應的濃度及其響應值，分別繪制五種大麻酚的標準曲線，結(jié)果表明在0.05~5.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，五種大麻酚的響應強度值與濃度有很好的線性關系，且五種大麻酚的線性相關系數(shù)R2≥0.997。將添加有大麻酚標準品的巧克力樣品提取溶液逐步稀釋，進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，計算其峰高與基線噪音高之比，當S/N=3（S為對照品峰高，N為基線噪音高）時的對照品濃度即為方法的檢出限（LOD），得到 CBDA、CBD、CBN、THC、THCA的檢出限為 0.01 μg/mL，即0.05 mg/kg；當S/N=10時的濃度為方法的定量限（LOQ），得到 CBDA、CBD、CBN、THC、THCA的定量限為0.15 mg/kg，結(jié)果見表4。本文對比了其他文獻方法的定量數(shù)據(jù)[13?14]，本文方法具有更低的定量限，比文獻方法要低1~2個數(shù)量級，更適用于微量添加大麻酚的巧克力等食品的檢測。

表4 五種大麻酚的標準曲線線性范圍、檢出限及定量限Table 4 Linear range, LOD and LOQ of five cannabinoids

2.4.2 精密度和穩(wěn)定性 本文對方法的重現(xiàn)性和精密度進行了驗證，其日內(nèi)和日間的精密度結(jié)果見表5。根據(jù)表5數(shù)據(jù)可得，五種大麻酚在日內(nèi)測定6次的相對標準偏差值RSDs范圍為2.0%~4.3%，日間連續(xù)3 d測定6次的相對標準偏差RSDs范圍為2.5%~4.7%，日內(nèi)精密度和日間精密度二者的RSDs值均<5%，說明該方法具有良好的精密度及穩(wěn)定性。

表5 五種大麻酚的精密度測試結(jié)果（n=6）Table 5 Intraday and interday precisions of the method（n = 6）

2.4.3 加標回收率 本文對三個加標水平1.25、2.50、5.00 mg/kg的巧克力樣品進行的加標回收實驗結(jié)果見表6。由表6數(shù)據(jù)可得，CBDA的回收率在94.5%~103.2%之間，RSDr<3.2%，CBD的回收率在98.5%~109.0%之間，RSDr<2.0%；CBN的回收率在96.2%~102.7%之間，RSDr<4.9%；THC的回收率在91.8%~102.3%之間，RSDr<4.6%；THCA的回收率在92.0%~108.8%之間，RSDr<4.9%，五種大麻酚的加標回收率在91.8%~109.0%，其RSDr值在1.5%~4.9%。該結(jié)果表明，本研究建立的檢測方法在不同加標水平下，具有較高的回收率和良好的精密度，能夠滿足巧克力樣品中5 種大麻酚類物質(zhì)檢測的要求。

表6 巧克力樣品中五種大麻酚的回收率測定結(jié)果（n=6）Table 6 The recoveries of five cannabinoids at three spiked concentrations and relative standard deviations（RSD）in dark chocolate samples（n = 6）

2.4.4 實際樣品檢測 以本方法的提取方法和儀器條件對市售的兩種黑巧克力進行五種大麻酚的測定，結(jié)果顯示兩種黑巧克力中均未檢出五種大麻酚。

3 結(jié)論

本文建立了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的同時檢測黑巧克力中五種大麻酚類物質(zhì)的分析方法，并對該方法進行了方法學驗證。結(jié)果表明，該方法的日內(nèi)和日間精密度的相對標準偏差RSDs值均<5%，說明該方法具有良好的精密度和穩(wěn)定性；五種大麻酚物質(zhì)在三個加標水平下的回收率為91.8%~109.0%，RSDs<5%，說明該方法具有較高的準確性。同時本方法具有簡單、快速的特點，可以為大麻酚類物質(zhì)的檢測提供技術支持，又可以為國內(nèi)大麻酚類物質(zhì)的監(jiān)測和合理使用提供依據(jù)。