7.0T MR-DTI評估大鼠腦膠質瘤瘤周浸潤組織各向異性分數及纖維密度指數與皮質脊髓束損傷分級的相關性研究

賈曉雄，張國斌，夏鶴春(通信作者)

1 天津市環湖醫院神經外科 (天津 300350)；2 天津市顱腦損傷搶救中心 (天津 300350)；3 寧夏醫科大學總醫院神經外科 (寧夏銀川 750001)；4 寧夏顱腦疾病國家重點實驗室(寧夏銀川 750001)

膠質瘤侵襲性生長對神經系統的破壞大多表現為對白質纖維束的侵襲,對于涉及皮質脊髓束的膠質瘤，神經功能障礙往往是由于運動傳導束的破壞、推擠或者變形[1-3]。因此，評估皮質脊髓束不同損傷程度能夠為制定更好的神經治療策略提供有價值的信息。

彌散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)已經被證實可以區分纖維束的損傷程度并且用于量化分析皮質脊髓束的侵襲程度。有學者已經證實各向異性分數(fractional anisotropy，FA)在靠近腫瘤側白質區域是降低的，在瘤周區域，FA較低，證明FA在瘤周區域受到病變的影響[4-6]。纖維密度指數(fiber density index，FDi)是用于顯示纖維束上一個單位體積的纖維束密度，可以提供有效的信息評估腫瘤的邊界區域和瘤周區域白質纖維束的分布[7-9]。纖維束示蹤成像(diffusion tensor tractography，DTT)是無創的，通過在纖維束行進區域設置3D感興趣區來可視化顯示白質纖維束的技術，可以顯示出特定的纖維傳導束[4]。此外，腫瘤細胞增殖和侵襲能夠導致皮質脊髓束的破壞，而破壞的程度可以反映它的生物學行為[10]。

DTI能夠評估纖維束的損傷程度，并且被用于患者神經功能檢測評估。然而，就我們所知目前少有報道將相對各向異性分數(relative fractional anisotropy，rFA)和相對纖維密度指數(relative fiber density index，rFDi)作為DTI量化參數指標應用于腦膠質瘤影響下的皮質脊髓束損傷程度分類中，并且與大鼠膠質瘤病理結果評估相結合。

因此，在本研究中，我們建立大鼠腦膠質瘤模型并選取瘤周浸潤區域感興趣區，測量瘤周區域和健側相對應區域FA和FDi，并計算rFA和rFDi。此外，大鼠處死后行病理檢測，評估瘤周區域腫瘤細胞浸潤與DTI參數分析纖維束損傷程度的相關性。

1 材料與方法

1.1大鼠腦膠質瘤模型建立

本研究選用C6細胞系，SD大鼠14只，均為成年雄性，體質量約0.25 kg。C6細胞系用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基培養，后建立大鼠腦膠質瘤模型，具體操作步驟及方式詳見前期已發表文章[11-12]。動物研究相關步驟經過寧夏醫科大學總醫院倫理委員會審批并同意。

1.2小動物磁共振掃描

磁共振掃描時間點為建模后第10天，掃描結束后處死大鼠行病理檢查。本研究采用7.0T磁共振掃描儀(Bruker BioSpec 70/30 USR，德國)，成像線圈選擇小動物專用線圈，麻醉使用小動物呼吸麻醉機(MATRX VIP3000，美國)實時麻醉，監護采用小動物監護/門控系統(SAⅡ Model 1030，美國)記錄大鼠呼吸、心電、體溫；麻醉后迅速將大鼠放入磁共振掃描床使用大鼠專用牙桿及呼吸面罩進行持續氣體吸入；掃描過程中監測大鼠呼吸、心電、體溫，掃描期間利用循環加熱墊維持大鼠溫度。

T1掃描采用加權快速自旋回波(RARE)序列，采集11層大鼠頭顱冠狀位圖像，掃描參數為，TR=1 500 ms，TE=6.5 ms，FOV=20 mm×20 mm，掃描層厚為0.5 mm，矩陣為256×256，反轉角90°；T2掃描采用超級弛豫增強快速采集(Turbo-RARE)序列，采集11層大鼠頭顱冠狀位圖像，掃描參數為，TR=2 500 ms，TE=33 ms，FOV=20 mm×20 mm，掃描層厚為0.5 mm，矩陣為256×256，反轉角90°；BOLD-fMRI掃描參數，TR=160 ms，TE=33 ms，FOV=8.0 cm×6.4 cm，矩陣為192×128；DTI-MRI掃描參數，TR=5 000 ms，TE=27 ms，FOV=4.0 cm×4.0 cm，反轉角90°，矩陣為128×128，掃描開始前，通過尾靜脈注射造影劑0.1 mmol/Kg Gd-DTPA(德國)，后用300 μl鹽水沖管；掃描結束后，原始數據傳輸至工作站處理，掃描數據通過MATLAB工作站進行分析；FA，FDi的測定是通過在瘤周區域及對側相對應區域選取感興趣區(region of interest，ROI)來完成；為了增加測量的準確性，每側的ROI都選取相應區域內不同的5個點[13-14]，后計算rFA(相對FA=患側瘤周FA/健側對稱FA)和rFDi(患側瘤周FDi/健側對稱FDi)。

1.3皮質脊髓束損傷分級

（1）奉新縣可以促進生態環境保護與資源開發利用相結合，重點發展山林經濟，大力發展毛竹、苗木、油茶和獼猴桃四大林業基礎產業。通過宣傳、政策支持，調動社會積極性，吸引社會資金投入到四大產業，聯合建設生產基地；培養或引進農業科技人才和國際化經營管理人才，大力推廣種植技術，拓展市場；統一生產標準，合理規避綠色壁壘，創新名牌農產品，打造農業一體化示范園。同時依托現有的農產品資源，升級現有的奉新工業園區，引進資金，大力發展輕工業即農產品加工業，打造特色的奉新毛竹工藝品和獼猴桃深加工產品，利用交通、信息渠道擴散到周邊區域，甚至輻射到周邊省市，推動特色品牌產品走出去。

通過選取雙種子點方法來示蹤皮質脊髓束，利用BOLD-fMRI顯示大鼠運動激活區域作為起始種子點，將大腦腳設置為示蹤的終點，同時通過兩個感興趣的部分纖維束視為皮質脊髓束[15]。在本研究中，我們將14只大鼠腦膠質瘤模型中皮質脊髓束的損傷程度分為兩級：(1)推擠：纖維束示蹤成像提示受累皮質脊髓束位置改變，未見明顯破壞、浸潤，偶有纖維束表現為分散、壓迫；(2)破壞：纖維束示蹤成像表現為受累纖維束的部分斷裂、破壞，FA圖上表現為相應區域各項異性明顯下降甚至無法測量出纖維束[10]。

1.4病理檢測

磁共振掃描結束后，大鼠處死進行病理檢查，所有大鼠均行心臟灌注，后快速離斷頸部去處顱骨，取出腦組織；4%多聚甲醛固定24 h，病理切片選取與DTI腫瘤最大層面腦組織做前后連續切片；每個腫瘤標本進行常規HE染色及免疫染色Ki67染色[16]，以明確腫瘤細胞浸潤程度以及腫瘤與白質纖維束的位置關系。

1.5統計學分析

采用GraphPad Prism Version 5.0軟件，對腫瘤細胞實際浸潤程度與rFA，rFDi的相關性進行分析，組間進行Student t test檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1瘤周浸潤區域FA、FDi較健側對稱區域下降

瘤周區域及健側相對應區域感興趣區FA和FDi用來表示(圖1)。瘤周區域平均FA(圖1A)是0.6014，對側區域平均FA是0.6964，差異有統計學意義(P<0.05)；瘤周區域平均FDi(圖1B)是1.5761，對側區域平均FDi是5.5299，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果提示，腦膠質瘤瘤周區域的浸潤性生長導致了患側各向異性分數及纖維束密度下降。

注：圖1A為大鼠腦膠質瘤瘤周區域FA<健側對稱區域，差異有統計學意義(P<0.05)，圖1B為大鼠腦膠質瘤瘤周區域FDi<健側對稱區域，差異有統計學意義(P<0.05)；瘤周區域(peritumoral areas，PA)，健側對稱區域(contralateral，Con)，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2rFA、rFDi下降與腫瘤細胞浸潤相關

為進一步驗證纖維束損傷是否與惡性腫瘤細胞對瘤周區域的浸潤有關，本研究進行了rFA和rFDi與瘤周區域腫瘤細胞數、腫瘤細胞增殖指數的相關性分析，結果表明，瘤周區域腫瘤細胞數與rFA和rFDi負相關(r=-0.8581，r=-0.5077)(圖2A)；瘤周區域惡性腫瘤細胞增殖數與rFA和rFDi負相關(r=-0.8411，r=-0.5755)(圖2B)。以上結果提示，腦膠質瘤瘤周區域的惡性腫瘤細胞浸潤程度可能導致患側纖維束的破壞。

注：如圖2A為瘤周區域惡性腫瘤細胞數與rFA及rFDi成負相關；如圖2B為瘤周區域惡性腫瘤細胞數增殖指數與rFA及rFDi成負相關。腫瘤細胞比(tumor cells%)=瘤周區域腫瘤細胞/瘤周區域細胞總數，增殖指數(proliferation index%)=瘤周區域Ki67染色陽性細胞/瘤周區域惡性腫瘤細胞總數，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3rFA和rFDi評估纖維束損傷程度

為進一步評估rFA和rFDi對纖維束損傷程度分級的意義，研究對不同受損級別纖維束損傷程度與rFA和rFDi進行了對比(圖3)，并進行了不同纖維束損傷級別間病理檢測(圖4)。重度纖維束受損組rFA(0.7840)較輕度纖維束受損組rFA(0.9238)明顯下降(圖3A)，而rFDi在重度纖維束受損組(0.2494)較輕度受損組rFDi(0.2891)僅表現為下降趨勢(圖3B)，差異無統計學意義(P>0.05)。

注：圖3A為重度纖維束受損組rFA較輕度纖維束受損組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，圖3B為重度纖維束受損組rFDi較輕度纖維束受損組降低，表現出降低的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。皮質脊髓束輕度受損(Grade_mild)，皮質脊髓束重度受損(Grade_severe)，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖4A、B為惡性腫瘤區域10倍(A)和40倍(B)HE染色，可見腫瘤細胞核異形性高，核大且深染，圖4C、D為瘤周區域10倍(C)和40倍(D)Ki67染色，可見瘤周區域惡性腫瘤細胞浸潤性生長。

3 討論

對于腦膠質瘤患者，病變對神經系統的破壞很多時候表現為對纖維傳導束的侵襲或者推擠，所以纖維束損傷程度的分級能夠為手術切除中有效保護神經功能提供有價值的信息[10，17]。本研究的目的就是通過量化的rFA和rFDi參數值來評估受膠質瘤影響的神經纖維束損傷程度。

DTI參數可用于評估不同級別膠質瘤瘤周水腫程度和惡性腫瘤細胞浸潤程度[15，18]。本研究結果顯示，瘤周區域和對側對稱區域的FA和FDi不同，表現為瘤周浸潤區域FA和FDi下降，rFA和rFDi與瘤周區域腫瘤細胞和增殖指數負相關；病理染色與DTI參數結果顯示，瘤周區域浸潤的腫瘤細胞數目和增殖指數增加表明白質纖維束的損傷程度增加。由此推測，瘤周區域FA和FDi的下降很可能歸因于腫瘤細胞的浸潤和增殖。因此，研究結果證實腦膠質瘤惡性腫瘤細胞的浸潤是導致白質纖維束損傷的重要原因。

DTI可以顯示顱腦腫瘤患者的纖維束完整性以及受腫瘤影響的纖維束走形[7，19]。本研究證實瘤周區域rFA和rFDi在不同纖維束損傷分類中是不同的。在2013年本組的一篇臨床報道[20]中證實，受腫瘤影響的白質纖維束分類能夠作為判斷腫瘤全切或者部分切除的一個指標。本研究結果顯示，膠質瘤侵襲導致皮質脊髓束損傷程度與rFA和rFDi相關，提示DTI參數可以描述受腫瘤影響的纖維束不同損傷程度分類。因此，rFA和rFDi可以用來評估受腫瘤影響的瘤周區域皮質脊髓束的纖維走形，而對皮質脊髓束損傷分類的目的則是為顯示腫瘤與正常腦組織之間的關系提供有價值的信息。

本研究中應用DTI參數與病理結果相結合來評估纖維束損傷程度，進一步研究擬應用其他不同的病理染色方法描述白質纖維束，以期更加準確、直觀的反應腫瘤細胞侵襲對白質纖維束損傷的影響。

綜上所述，在大鼠腦膠質瘤模型中，DTI參數可以量化評估纖維束損傷程度，并且量化參數評估可以為描述惡性腫瘤與受損纖維束之間的關系提供有價值的信息。