食品添加劑2,3-丁二酮通過激活NF-κB誘發肝細胞L02發生凋亡

吳蘭 劉陽 張雯翔 王琛 劉暢

摘要 在現代社會中，食品添加劑在食品工業的生存和發展中起到了關鍵作用。作為食品添加劑家族的重要一員，2，3-丁二酮（2，3-butanedione，BUT）被廣泛用于制造牛奶香精。然而為了降低成本，生產商使用BUT作為原料，對食品的安全性構成了極大的威脅。近年來，已發現BUT可引起肺部閉塞性細支氣管炎，但BUT對肝臟是否具有潛在毒性仍然未知。本研究使用L02細胞作為體外模型，檢測細胞暴露于BUT 12 h是否會引起肝毒性。實驗結果表明，當BUT的劑量達到0.5 mM時，肝細胞活性顯著降低，出現大量死細胞，細胞活性氧增加并且線粒體膜電位降低，Capase-3活性顯著升高，Nf-κB和Caspase-3基因與蛋白表達量均升高。這些結果表明，當BUT濃度達到一定的劑量閾值時，可以引起一定程度的肝細胞凋亡。

關 鍵 詞 2，3-丁二酮;L02細胞;細胞凋亡;Nf-κB;Caspase-3

中圖分類號 TQ657.1? ? ?文獻標志碼 A

Abstract In modern society， food additives play an important role in the survival and development of the food industry. Among which， 2，3-butanedione （BUT） is widely used in the production of milk flavor. In order to reduce costs， manufacture uses the BUT as a raw material， which would pose a great threat to the food safety. In recent years， it has been reported that BUT causes pulmonary bronchiolitis obliterans. However， the potential toxicity of BUT on the liver remains unknown. In the present study， we used an in vitro model of L02 cells to test whether exposure to BUT for 12 h would cause hepatotoxicity. Our results showed that BUT caused an extreme reduction in the hepatocyte viability and massive cell death， increased reactive oxygen species production， decreased mitochondrial membrane potential， significantly increased the activity of Capase-3， and finally elevated Nf-κB and Caspase-3 genes expression. All in all， our results indicate that BUT causes hepatocytes apoptosis when reaching to a certain dose threshold.

Key words 2， 3-butanedione; L02 cells; apoptosis; Nf-κB; Caspase-3

0 引言

在社會經濟快速發展的今天，食品工業已取得了長足的進步，其中食品添加劑的重要性也日益凸顯[1]。然而，各種食品安全問題也正不斷出現[2]。為減少或避免食品安全問題的發生，防止其對人體產生不利影響，人們必須采取相應措施，減少食品中有害添加劑的使用。隨著中國社會主義市場與計劃經濟的蓬勃發展，食品工業也隨之快速發展與進步，食品中“色”、“香”越來越受到消費者的青睞。食品添加劑已成為現代食品中不可或缺的一部分，在改善食品的外觀、顏色和味道方面發揮著重要作用[3-7]。另一方面，對食品添加劑的非法使用也會引起嚴重疾病的發生，如心腦血管疾病、癌癥等[8-9]。目前，世界上已使用了25 000多種食品添加劑（其中80%是香料）[10]。能夠直接被人們使用的約3 000～4 000種，其中600～1 000種食品添加劑為人們所常用。由于每個國家的食品安全控制要求和技術的差異，其對食品添加劑的可允許使用類型和范圍是不同的。例如，美國食品藥品監督管理局（FDA）已發布了2 922種食品添加劑，其中1 755種得到管理。目前，中國的食品添加劑已達23類，超過2 000種，主要包括香料，消泡劑，防結塊劑，增味劑，防腐劑，膨松劑等[10]。

2，3-丁二酮（BUT），也稱為二乙酰，是一種重要的香料，顏色介于黃色和淺綠色之間，具有強烈的奶油香氣[11]。它不僅是乳制品中的重要成分，同時也是奶油、奶酪和其他需要乳白味的非乳制品的重要香料[12]。此外，BUT還可用作明膠[13]的固化劑，攝影用粘合劑[14]，以及藥物[15]，農藥[4，16]和其他精細化學品[17]的合成中間體。由于其廣泛的應用，BUT正在受到越來越多的關注。除人工添加外，脂類[18]、碳水化合物[19]和維生素等食物成分可通過多種方式形成，如過氧化、氧化分解、美拉德反應[20]、光敏氧化[15，21-22]等反應。雖然BUT被美國FDA[23]歸類為公認安全類添加劑，但其在各個方面的安全性依然需要人們加以重視。目前國內外關于BUT安全性的研究報告很少，相關研究也有待加強。

近年來的研究表明，BUT具有閉塞性細支氣管炎和誘導氧化應激等毒性作用[15]。目前，關于直接食用BUT引起的大鼠急性中毒的報道尚未確定，但有一些有效的證據顯示BUT的劑量可能誘發包括肝臟在內的多種器官的損傷[23]。但是，關于由BUT引起的肝損傷的報道并不多。因此，選擇BUT來損害正常肝細胞，以便在細胞水平上初步發現BUT對肝臟的損害。希望本文的研究可以為BUT的健康危害提供可靠的理論依據，并為修訂BUT在食品中應用的有限標準提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

2，3-丁二酮（中國阿拉丁公司）;CCK-8試劑（中國，建成生物工程研究所）;線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、活性氧檢測試劑、Caspase-3活性檢測試劑（中國，碧云天公司）;RPMI-1640培養基（美國，賽默飛公司）;抗體CASPASE-3、NF-κB（美國，Santa Cruz Biotechnology公司）;二抗（美國，Jackson ImmunoResearch公司）;細胞裂解緩沖液（中國，碧云天公司）;苯基甲基磺酰氟（PMSF，美國，Sigma公司）;BCA蛋白測定試劑盒（中國，碧云天公司）;Trizol 、PrimeSc試劑盒（日本，Takara公司）。

1.2 儀器

GENE SPEED離心機（中國，基因有限公司）;Tanon EPS 300（中國，天能有限公司）;Tanon 6600發光成像工作站（中國，天能有限公司）;RT- PCR儀（美國，賽默飛有限公司）;Light Cycle 480II PCR儀（瑞士，羅氏公司）;倒置熒光顯微鏡（日本，Nikon公司）;酶標儀（瑞士，TECAN貿易有限公司）。

1.3 細胞

人正常肝臟細胞L02細胞購買于上海中科院并且長期保存于本實驗室。

2 方法

2.1 細胞培養

在包含L-谷氨酰胺，25 mM HEPES緩沖液和碳酸氫鈉的RPMI-1640培養基中培養人正常肝細胞L02。該培養基補充有MEM非必需氨基酸（1%）。所有細胞均補充有10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素，并在37°C下用5%的CO2培養。待細胞密度達到70%～90%時，采用0.25%胰酶消化傳代。

2.2 CCK-8法

將對數生長期的細胞經胰酶消化后種植于96孔板中，各給藥濃度細胞設置復孔3孔。待細胞濃度密度增殖至60%～70%時，分別加入0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mM的BUT培養24 h，將10 μL CCK-8加入96孔板的每個孔中，并在37 °C下孵育2.5 h。用酶標儀在450 nm波長下測定各孔的吸光度，并計算各濃度的平均值，分析并記錄實驗結果。

2.3 BUT處理誘導L02細胞的形態變化

細胞傳代并種植于6孔板后，培養細胞待密度為60%～70%時，加入不同濃度的BUT，待處理12 h后，用光學顯微鏡（200×）觀察細胞后，并拍攝下不同濃度細胞的狀態。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

將BUT處理12 h的細胞培養基吸入合適的離心管中，用PBS沖洗貼壁細胞一次，加入適量胰蛋白酶細胞消化液消化細胞。加入上述中收集的細胞培養液，攪拌均勻，移入離心管，1 000g離心5 min，棄上清液，收集細胞，用PBS輕輕重懸。再次離心重懸的細胞，5 min 1 000g，棄上層液， 加入195 μL Annexin V-EGFP結合液輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-EGFP，輕輕混勻。再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫（20～25 ℃）避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。并使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2～3次以改善染色效果。隨即進行流式細胞儀檢測。

2.5 線粒體膜電位（MMP）測定

細胞種植于六孔板在給與BUT刺激12 h后，吸出培養液，用PBS溶液洗滌一次，然后加入1 mL細胞培養液以及1 mL JC-1染色溶液并充分混合。在細胞培養箱中于37 ℃孵育20 min。在溫育期間，以每1 mL JC-1染色緩沖液（5×）4 mL蒸餾水的比例制備適量的JC-1染色緩沖液（1×），并置于冰浴中。在37 ℃下溫育后，吸出上清液，并用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌兩次。即加入2 mL細胞培養基，其中可能含有血清和酚紅。在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2.6 細胞活性氧（ROS）測定

DCFH-DA用無血清培養基按1∶1 000稀釋至終濃度10 μM。待細胞接受BUT 12 h刺激后，用適當量的含有DCFH-DA的新鮮培養基更新細胞培養基，并在細胞培養箱中于37 ℃孵育20 min。用無血清細胞培養基洗滌細胞3次，以充分除去未被細胞吸收的DCFH-DA。使用488 nm的激發波長和525 nm的發射波長，通過熒光酶標儀檢測藥物處理后的熒光強度，以測量每種藥物濃度下細胞活性氧的程度。

2.7 活細胞Caspase-3活性檢測

細胞種植于96孔板中，待細胞密度大約達到70%時，不同濃度的BUT處理L02細胞12 h。用含5 μM底物的新鮮培養液或者PBS對細胞進行換液，Ac-DEVD -CHO抑制劑組要補充原來濃度的抑制劑。室溫避光孵育15～30 min。酶標儀設置激發波長485 nm，發射波長515 nm。記錄數據。

2.8 實時定量PCR（qPCR）

使用 Trizol 法提取總 RNA 后，用反轉錄試劑盒將 1 μg 的總 RNA 反轉錄為 cDNA，隨后，使用 SYBR Premix Ex Taq 檢測目的基因的 mRNA 表達水平，以人β-actin基因為內參。引物序列如下：

β-actin F：5’-GAAACTGCTGCCTCACATCCG-3’，R：5’-GCTGGCACAGTGACCTCACACG-3’;

NF-κB F：5’-CTACACAGGACCAGGGACAG-3’，R：5’-GCACAGCATTCAGGTCGTAG-3’;

Caspase-3 F：5’-ACTGGACTGTGGCATTGAGA -3’，R：5’-GCACA AAGCGACTGGATGAA-3’ 。

2.9 Western blot法檢測蛋白表達水平

RIPA 裂解液冰浴裂解肝細胞，收集總蛋白。取等量蛋白進行 SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入一抗（β-actin以1∶5 000稀釋，和 NF-κB和CASPASE-3以1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次后加入HRP 標記的二抗（1∶1 000稀釋），室溫下孵育1 h，使用 PBST 洗滌3次，每次10 min，采用ECL化學發光試劑顯影。

2.10 統計分析

使用軟件包Origin 8對獲得的結果進行統計分析。找到了每個研究參數的算術平均值和標準差（SD）。兩組之間的比較通過t檢驗確定對顯著性結果進行配對檢驗。與空白對照組（0 mM）做配對檢驗，顯著性水平為*P <0.05，**P<0.01為極顯著性差異。

3 結果

3.1 在體外用BUT直接處理肝細胞會降低細胞活力

為了評估BUT是否可以在體外影響肝細胞的存活力，用劑量從0 mM增加到4.0 mM的BUT劑量處理了L02細胞12 h。實驗表明，BUT 12 h后，低劑量的BUT對 L02細胞活力影響較小，當濃度增加至0.2 mM時細胞活力出現顯著性降低（P <0.05，細胞活力為87%）（圖1）。與未處理的細胞相比，在4.0 mM時，細胞活力約降低至19%（P <0.01）。累積計算法計算得到BUT的半數致死劑量（LD 50）值為2.0 mM。

3.2 細胞形態變化

用光學顯微鏡觀察細胞后，發現細胞間開始失去接觸，隨著BUT濃度的增加而分離。當BUT濃度達到4.0 mM時，發現健康形態特征和細胞完整性完全消失，可以清楚地看到死細胞。

3.3 BUT誘導L02細胞凋亡

為了確認BUT對人正常肝細胞凋亡的影響，使用Annexin V-PE / 7-AAD染色和流式細胞儀對凋亡細胞的數量進行了定量分析（圖3）。可以從圖3中看出隨著BUT濃度升高細胞的凋亡率明顯增加。當BUT處理濃度達到0.5 mM時（凋亡率增加至22%），與對照組相比已出現顯著性差異。待濃度達到2.0 mM，細胞的凋亡率達到57%，當濃度為4.0 mM時細胞幾乎全部凋亡（凋亡率為86%）。

3.4 BUT對L02細胞線粒體毒性的影響

為了更好地了解BUT是如何引起肝細胞活力降低，首先檢測了細胞線粒體的完整性。如圖4所示，用JC-1染色BUT處理的L02細胞后，發現1.0 mM的BUT即可引起線粒體損傷，且線粒體損傷程度與BUT濃度成正比。隨著濃度的增加代表線粒體膜電位下降的綠色熒光逐漸增加，直至4.0 mM時線粒體膜電位較高時的紅色熒光幾近消失。

3.5 BUT誘導L02細胞中ROS升高

為了進一步研究BUT處理引起L02細胞損傷，使用熒光酶標儀測量了細胞中活性氧的水平。實驗表明，直接暴露于BUT 12 h后，與未處理的細胞相比，細胞中ROS的含量隨著BUT的濃度增加呈劑量依賴性升高（圖5）。

3.6 L02細胞中Caspase-3活性與表達量升高

當細胞發生凋亡時，Caspase-3可被激活，因此對BUT處理的L02細胞的Caspase-3的活性進行檢測。實驗結果顯示，與空白組 Caspase-3比較，低濃度的BUT對細胞Caspase-3活性沒有明顯影響，當濃度達到2.0 mM，Caspase-3的活性顯著升高，（P <0.01），4.0 mM BUT組的Caspase-3活性極顯著性地升高，（P <0.01）。（圖6a））。RT-qPCR和Western blot檢測發現，當BUT濃度達到1.0 mM時，Caspase-3的mRNA和蛋白表達水平也均顯著性升高（圖6b）和6c））。

3.7 BUT濃度增加凋亡相關蛋白的變化

NF-κB信號通路廣泛存在于真核細胞內，參與多種基因的調控，對細胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應起著重要作用，因此我們通過RT-qPCR和Western blot實驗檢測BUT處理的L02細胞中NF-κB是否活化。如圖7所示，BUT可以在轉錄和翻譯水平活化NF-κB p65。這些結果表明，BUT可能是通過激活NF-κB信號通路誘導L02細胞的凋亡。

4 結論

肝臟作為常見的毒性靶器官，它能夠代謝血液循環中的異物，以幫助清除體內潛在毒素的影響。作為FDA批準的常見食品添加劑，BUT被廣泛用于牛奶味食品中[24-25]。值得注意的是，食品成分安全是FDA的首要任務。但近年來，據報道BUT可能對人肺造成諸如支氣管炎的毒性作用。鑒于肝臟是代謝血液循環中的異物以幫助清除體內潛在毒素的內在作用的主要器官之一，因此有理由懷疑其是BUT的另一個潛在毒性靶器官。但是，關于由BUT引起的肝臟損害的報道很少。因此，本文的研究發現了BUT可以一定程度的引起肝損傷，為修訂BUT在食品中應用的有限標準提供一些參考。

線粒體在細胞存活和細胞內環境的穩定維持中起著重要作用。線粒體的變化被認為是細胞凋亡的重要形態學變化，并且被認為是細胞凋亡的早期細胞標志物[26]。在本研究中，研究了線粒體的2個參數：線粒體膜電位（MMP）和活性氧（ROS）濃度。這2個指標從不同的肝毒性角度反映了細胞凋亡的基本機制。ROS在肝毒性機制中起作用，由于ROS水平升高會損害脂質、蛋白質或DNA，從而導致脂質過氧化和線粒體功能障礙[27]。MMP主要檢測線粒體內膜和外膜之間的電位差，這是早期評估潛在肝毒性藥物的常用指標[28]。線粒體在細胞存活和維持細胞內環境的穩定維持中起著重要作用[29]。在目前的研究中，BUT暴露后，活細胞數量減少，線粒體膜電位降低，ROS濃度增加，Caspase-3的活力及蛋白表達量升高，表明BUT誘導的肝毒性可能導致細胞凋亡。

生物體內最重要的信號傳導途徑之一是NF-κB通路，據報道，它可以激活與炎癥[30]，增殖，凋亡，轉移和侵襲[31]有關的基因，因此在細胞凋亡發生中起著至關重要的作用。NF-κB轉錄因子的激活通過NF-κB復合物的NF-κB p65成分的核易位而發生[32]。BUT已顯示在0.5～4.0 mM濃度下可促進人正常肝細胞L02細胞的NF-κB活性。因此，BUT引起的L02細胞凋亡可能是通過激活NF-κB活信號通路來實現的。

總而言之，BUT雖是FDA批準的常見食品添加劑，但在一定濃度下，應考慮其對肝臟的毒性。

參考文獻：

[1]? ? VINDEROLA G. Dried cell-free fraction of fermented milks：new functional additives for the food industry[J]. Trends in Food Science & Technology，2008，19（1）：40-46.

[2]? ? ADINOLFI F，DI PASQUALE J，CAPITANIO F. Economic issues on food safety[J]. Ital J Food Saf，2016，5（1）：5580.

[3]? ? BASTAKI M，FARRELL T，BHUSARI S，et al. Estimated daily intake and safety of FD&C food-colour additives in the US population[J]. Food Additives & Contaminants：Part A，2017，34（6）：891-904.

[4]? ? BERDAGUé J L，MONTEIL P，MONTEL M C，et al. Effects of starter cultures on the formation of flavour compounds in dry sausage[J]. Meat Science，1993，35（3）：275-287.

[5]? ? COLE G L，ENDLER J A. Artificial selection for food colour preferences[J]. Proc Biol Sci，2015，282（1804）：20143108.

[6]? ? KOYAMA K I，AMITANI H，ADACHI R，et al. Good appearance of food gives an appetizing impression and increases cerebral blood flow of frontal pole in healthy subjects[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition，2016，67（1）：35-39.

[7]? ? MIETH L，BELL R，BUCHNER A. Memory and disgust：Effects of appearance-congruent and appearance-incongruent information on source memory for food[J]. Memory，2016，24（5）：629-639.

[8]? ? FORTIN N D. PHOs：illegal food additives since 2005[J]. Food Technology，2014，68（11）：96.

[9]? ? YANG J，HAUSER R，GOLDMAN R H. Taiwan food scandal：The illegal use of phthalates as a clouding agent and their contribution to maternal exposure[J]. Food and Chemical Toxicology，2013，58：362-368.

[10]? MARTYN D M，MCNULTY B A，NUGENT A P，et al. Food additives and preschool children[J]. Proceedings of the Nutrition Society，2013，72（1）：109-116.

[11]? BLANCHARD E M，SMITH G L，ALLEN D G，et al. The effects of 2，3-butanedione monoxime on initial heat，tension，and aequorin light output of ferret papillary muscles[J]. Pflügers Archiv，1990，416（1/2）：219-221.

[12]? RINCON-DELGADILLO M I，LOPEZ-HERNANDEZ A，WIJAYA I，et al. Diacetyl levels and volatile profiles of commercial starter distillates and selected dairy foods[J]. Journal of Dairy Science，2012，95（3）：1128-1139.

[13]? MADAN P L，JANI R K，BARTILUCCI A J. New method of preparing gelatin microcapsules of soluble pharmaceuticals[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences，1978，67（3）：409-411.

[14]? AKHTAR M J，JACQUOT M，ARAB-TEHRANY E，et al. Control of salmon oil photo-oxidation during storage in HPMC packaging film：Influence of film colour[J]. Food Chemistry，2010，120（2）：395-401.

[15]? MATHEWS J M，WATSON S L，SNYDER R W，et al. Reaction of the butter flavorant diacetyl （2，3-butanedione） with N-α-acetylarginine：a model for epitope formation with pulmonary proteins in the etiology of obliterative bronchiolitis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（24）：12761-12768.

[16]? KOVACIC P，COOKSY A L. Role of diacetyl metabolite in alcohol toxicity and addiction via electron transfer and oxidative stress[J]. Archives of Toxicology，2005，79（3）：123-128.

[17]? ROBINSON A，HESKETH H，LAHIVE E，et al. Comparing bee species responses to chemical mixtures：Common response patterns？[J]. PLoS One，2017，12（6）：e0176289. DOI：10. 1371/journal. pone. 0176289.

[18]? HANSEN A，SCHIEBERLE P. Generation of aroma compounds during sourdough fermentation：applied and fundamental aspects[J]. Trends in Food Science & Technology，2005，16（1/2/3）：85-94.

[19]? PAN D D，WU Z，PENG T，et al. Volatile organic compounds profile during milk fermentation by Lactobacillus pentosus and correlations between volatiles flavor and carbohydrate metabolism[J]. Journal of Dairy Science，2014，97（2）：624-631.

[20]? ZHOU Y M，XIE F，ZHOU X L，et al. Effects of Maillard reaction on flavor and safety of Chinese traditional food：roast duck[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2016，96（6）：1915-1922.

[21]? COGHE S，GHEERAERT B，MICHIELS A，et al. Development of Maillard reaction related characteristics during malt roasting[J]. Journal of the Institute of Brewing，2006，112（2）：148-156.

[22]? COULOMBE J J，FAVREAU L. A new simple semimicro method for colorimetric determination of urea[J]. Clinical Chemistry，1963，9：102-108.

[23]? HUBBS A F，CUMPSTON A M，GOLDSMITH W T，et al. Respiratory and olfactory cytotoxicity of inhaled 2，3-pentanedione in sprague-dawley rats[J]. The American Journal of Pathology，2012，181（3）：829-844.

[24]? HUANG X L，QIN J J，LU S. Magnesium isoglycyrrhizinate protects hepatic L02 cells from ischemia/reperfusion induced injury[J]. International Journal of Clinical and Experimental Pathology，2014，7（8）：4755-4764.

[25]? PARK B K，LAVERTY H，SRIVASTAVA A，et al. Drug bioactivation and protein adduct formation in the pathogenesis of drug-induced toxicity[J]. Chemico-Biological Interactions，2011，192（1/2）：30-36.

[26]? JEVTI? G，NIKOLI? T，MIR?I? A，et al. Mitochondrial impairment，apoptosis and autophagy in a rat brain as immediate and long-term effects of perinatal phencyclidine treatment—influence of restraint stress[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry，2016，66：87-96.

[27]? GU L L，SHEN Z L，LI Y L，et al. Oxymatrine causes hepatotoxicity by promoting the phosphorylation of JNK and induction of endoplasmic reticulum stress mediated by ROS in LO2 cells[J]. Moleculer Cells，2018，41（5）：401-412.

[28]? DAN Z L，POPOV Y，PATSENKER E，et al. Hepatotoxicity of alcohol-induced polar retinol metabolites involves apoptosis via loss of mitochondrial membrane potential[J]. The FASEB Journal，2005，19（7）：845-847.

[29]? NIU L Q，HUANG J，YAN Z J，et al. Fluorescence detection of intracellular pH changes in the mitochondria-associated process of mitophagy using a hemicyanine-based fluorescent probe[J]. Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2019，207：123-131.

[30]? LI Y C，LU Z Y，HUANG Y，et al. F（ab'）2 fragments of anti-oxidized LDL IgG attenuate vascular inflammation and atherogenesis in diabetic LDL receptor-deficient mice[J]. Clinical Immunology，2016，173：50-56.

[31]? DOLCET X，LLOBET D，PALLARES J，et al. NF-kB in development and progression of human cancer[J]. Virchows Archiv，2005，446（5）：475-482.

[32]? FERRER T，RUPP J，PIPER D R，et al. The S4-S5 linker directly couples voltage sensor movement to the activation gate in the human ether-á-go-go-related gene （hERG） k+ channel[J]. Journal of Biological Chemistry，2006，281（18）：12858-12864.