馬鈴薯晚疫病病原菌的分離及室內(nèi)藥劑篩選

魯進(jìn)恒，戴 晉，袁 謙，張中州，劉曉東，范志業(yè)

(1.漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 漯河 462000；2.舞陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，河南 舞陽(yáng) 462000)

馬鈴薯是一種糧菜兼用作物，因其適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣，被列為全球第三、中國(guó)第四大農(nóng)作物[1]。馬鈴薯的塊莖營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅淀粉含量高，而且富含多種人體必須的維生素和氨基酸[2]，有巨大的社會(huì)需求，是一種既可鮮食又可深加工的農(nóng)產(chǎn)品。河南省作為傳統(tǒng)的農(nóng)耕區(qū)，馬鈴薯一直保有相當(dāng)?shù)姆N植面積，特別是近年來(lái)，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，家庭農(nóng)場(chǎng)的出現(xiàn)，馬鈴薯因其生產(chǎn)周期短，經(jīng)濟(jì)效益高的特點(diǎn)，在本省的栽培面積呈逐年擴(kuò)大趨勢(shì)。

晚疫病(Potato late blight)是馬鈴薯生產(chǎn)中的第一大病害，每年在全球范圍造成經(jīng)濟(jì)損失約67億美元[3～4]，對(duì)我國(guó)造成損失約10億美元[5]。該病害既能侵染植株葉片也可危害地下莖塊，當(dāng)其初侵染葉片時(shí)，會(huì)在葉的邊緣形成水潰狀斑點(diǎn)，病葉被面有霉層，潮濕環(huán)境下病狀蔓延速度會(huì)加快，最后致整個(gè)植株呈焦黑狀；當(dāng)其侵染薯塊時(shí)，會(huì)在薯塊表面形成灰紫或褐色不規(guī)則凹陷病斑，病斑下的薯肉呈深度不同的褐色壞死，直至整塊壞死[6]。

漯河市為豫中南重要的糧食和蔬菜的生產(chǎn)及轉(zhuǎn)運(yùn)基地，馬鈴薯在當(dāng)?shù)匾恢北蛔鳛槭卟朔N植。由于種植年限長(zhǎng)，重茬現(xiàn)象嚴(yán)重，田間積累了大量的病原，晚疫病的發(fā)生程度呈逐年加重的趨勢(shì)。但本地區(qū)關(guān)于馬鈴薯晚疫病的相關(guān)研究較少，缺乏有效的防治方法，從服務(wù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的角度出發(fā)，本課題組對(duì)罹患晚疫病的葉片進(jìn)行了組織分離，將分離純化得到的菌株進(jìn)行了致病性測(cè)定，并用室內(nèi)毒力測(cè)定法進(jìn)行了防治藥劑的篩選，以期為本地馬鈴薯晚疫病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：①馬鈴薯晚疫病病葉由漯河市舞陽(yáng)縣辛安鎮(zhèn)種植田采集；②黑麥培養(yǎng)基(RSA)[7]：黑麥60 g，蔗糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L。

供試藥劑：①80%代森錳鋅可濕性粉劑，先正達(dá)作物保護(hù)有限公司生產(chǎn)，商品名稱(chēng)山德生；②500 g·L-1氟啶胺懸浮劑，日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社，商品名稱(chēng)福帥得；③23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑，先正達(dá)作物保護(hù)有限公司生產(chǎn)，商品名稱(chēng)瑞凡；④46%氫氧化銅可濕性粉劑，美國(guó)杜邦公司生產(chǎn)，商品名稱(chēng)可殺得叁仟；⑤250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑，先正達(dá)作物保護(hù)有限公司生產(chǎn)，商品名稱(chēng)阿米西達(dá)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用薯片夾葉法[8]進(jìn)行病原菌分離。用無(wú)菌水反復(fù)沖洗病葉，去除表面塵土后晾干，剪取葉片病健交界處4～5mm2組織塊，先置于75%酒精溶液處理3～4 s，后置于0.1%升汞消毒15～20 s，取出用無(wú)菌水反復(fù)沖洗后備用。將健康薯塊洗凈并晾干，浸入75%酒精溶液處理10～15 s，取出燒干，切成厚7 mm左右的薯片，取制備好的病葉夾于兩薯片中間，濾紙保濕20℃培養(yǎng)，待在薯片上長(zhǎng)出霉層，直接挑取霉層置于RSA上20℃培養(yǎng)。5 d后，對(duì)菌落進(jìn)行單孢純化[9～10]，獲得純化菌株后保存于RSA平板上，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定 采用菌絲塊接種法進(jìn)行致病性測(cè)定[11]。取健康的馬鈴薯葉片，經(jīng)無(wú)菌水沖洗干凈后用75%酒精表面消毒1 min，再用無(wú)菌水沖洗殘留酒精，置于培養(yǎng)皿中備用，皿中鋪無(wú)菌紗布保濕。將分離獲得的純化菌株轉(zhuǎn)接于RSA上，于20℃活化培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，用接種針對(duì)葉片作刺傷處理后，將菌餅接種到傷口處，以無(wú)菌RSA塊作為對(duì)照，置于20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)(光周期12L∶12D)，每24 h觀察一次。待發(fā)病后再次從病斑處分離病原菌，并與首次分離的病原菌作對(duì)比。

1.2.3 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定 利用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]測(cè)定5種藥劑對(duì)該致病菌的抑制作用。試驗(yàn)準(zhǔn)備：依據(jù)RSA的配方配制適量的培養(yǎng)基，并將其以50 mL為單位分裝滅菌備用，同樣準(zhǔn)備以100 mL為單位無(wú)菌水若干備用。試驗(yàn)過(guò)程：先將50 mL的RSA融化，冷卻至45℃左右，后加入一定量的藥液，分別配成不同梯度的含藥培養(yǎng)基，搖勻后倒入直徑6 cm的滅菌培養(yǎng)皿中。用直徑為5 mm的打孔器將活化好的供試菌種打取菌餅接入含藥培養(yǎng)基中央，置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲相對(duì)抑制率。

利用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求出各藥劑對(duì)馬鈴薯晚疫病原菌的毒力回歸方程、抑制中濃度EC50、相關(guān)系數(shù)及置信區(qū)間。

相對(duì)抑制率( % )= (對(duì)照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑)/對(duì)照菌落平均直徑×100

表1 5種殺菌劑的濃度梯度

2 結(jié)果與分析

2.1 分離及純化結(jié)果

由分離、純化獲得分離物，編號(hào)為L(zhǎng)HW202009。將該分離物接種在RSA平板上，20℃下黑暗培養(yǎng)7d后，可形成圓形或近圓形菌落(圖1-A)。菌絲為白色且稀薄，部分老齡菌絲發(fā)黃。鏡檢狀態(tài)下(圖1-B)：菌絲無(wú)色無(wú)隔膜，孢子囊著生于菌絲膨大的節(jié)處，各個(gè)分節(jié)的長(zhǎng)短不均勻。孢子囊呈檸檬形，大小為(2～45)μm×(12～25)μm，一端具乳突，著生端有小柄，易脫落。這些形態(tài)與馬鈴薯晚疫病致病菌——Phytophthorainfestans的形態(tài)相吻合。

圖1 病原菌菌落形態(tài)和孢子形態(tài)

2.2 致病性鑒定

將該菌在RSA平板上培養(yǎng)5d后，取菌落邊緣的菌絲塊接種在健康的刺傷馬鈴薯葉片上，光周期12L∶12D條件下光照培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)。4d后接種葉片顯癥，癥狀與田間調(diào)查相同(圖2)，均為葉片邊緣先發(fā)病，開(kāi)始為一水漬狀斑點(diǎn)，后向葉中部迅速擴(kuò)大。且病斑與健部無(wú)明顯界限，病斑處有白色絨毛狀霉層，葉片背部癥狀更明顯。將接種后發(fā)病的葉片進(jìn)行二次分離，分離獲得物與田間分離的病原菌一致，確定該分離物為本地區(qū)馬鈴薯晚疫病致病菌。

圖2 馬鈴薯晚疫病田間癥狀(A)及接種后的發(fā)病癥狀(B)

2.3 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定

從測(cè)定的5種殺菌劑對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的毒力結(jié)果(表2)可知：供試藥劑對(duì)晚疫病菌株均有一定的抑制效果，但各藥劑間差異明顯。其中雙炔酰菌胺的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.0276 mg·L-1；其次為嘧菌酯，EC50為0.036 mg·L-1，其余被測(cè)藥劑的毒力大小依次為氫氧化銅、氟啶胺、代森錳鋅，EC50分別為0.3234 mg·L-1、0.3948 mg·L-1和7.0385 mg·L-1。

表2 5種殺菌劑對(duì)馬鈴薯晚疫病病原菌的抑制作用

3 結(jié)論與討論

晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上的重要病害，可引起葉片枯萎，嚴(yán)重致時(shí)整株焦化枯死，已成為制約漯河市馬鈴薯生產(chǎn)主要因素。試驗(yàn)通過(guò)組織分離法分離出了本地區(qū)的馬鈴薯晚疫病致病菌——Phytophthorainfestans。相關(guān)研究表明Phytophthorainfestans起源于墨西哥托盧卡河谷[13]，分為A1、A2兩種交配類(lèi)型，兩種類(lèi)型在中國(guó)均存在。據(jù)國(guó)內(nèi)張鉉哲[14]、王文橋[15]、楊志輝[16]等學(xué)者的研究報(bào)道，A1交配型主要出現(xiàn)在北方地區(qū)，A2交配型在南方地區(qū)較多。漯河市居中國(guó)南北方地理交界帶，分離出的致病菌交配類(lèi)型尚未確定，且不能確定是那種交配類(lèi)型在本地區(qū)占主導(dǎo)，這將是下一步研究探索的方向。

在分離出致病菌的基礎(chǔ)上，為了有針對(duì)性地防治本地區(qū)的馬鈴薯晚疫病，筆者研究選取了生產(chǎn)中常用的5種殺菌劑對(duì)Phytophthorainfestans進(jìn)行了毒力測(cè)定，以篩選出適宜本地區(qū)的防治藥劑。試驗(yàn)結(jié)果表明5種殺菌劑對(duì)該致病菌均有一定的抑制作用，但各藥劑間差異顯著。其中雙炔酰菌胺的效果最好，EC50僅為0.027 6 mg·L-1；其次為嘧菌酯，EC50為0.036 mg·L-1。代森錳鋅是5種殺菌劑中抑制效果最差的，EC50高達(dá)7.038 5 mg·L-1，分析其原因可能為代森錳鋅為傳統(tǒng)殺菌劑，在本地區(qū)常年大量使用，該病原對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性。基于毒力測(cè)定結(jié)果，參考劉波微[17]、遲會(huì)偉[18]、羅建軍[19]關(guān)于藥劑在田間防效的相關(guān)報(bào)道，在生產(chǎn)中推薦使用雙炔酰菌胺和嘧菌酯用于防治馬鈴薯晚疫病。這兩種殺菌劑皆為內(nèi)吸性殺菌劑，都有活性高的特點(diǎn)，且都有對(duì)作物、人、野生動(dòng)物和環(huán)境安全的特點(diǎn)[20～23]，建議兩種藥交替使用，以減緩抗藥性的發(fā)生。