不同提取條件對黃連中小檗堿含量的影響

張小斌，雷艷妮，陳書存

(1.商洛學院 健康管理學院、中國中醫科學院商洛中藥材GAP科研工程中心,陜西 商洛 726000；2.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院,陜西商洛 726000；3.商洛市中醫醫院，陜西 商洛 726000)

黃連屬毛莨科植物(Cop tisch inen sis Franch)、三角葉黃連(Coptis deltoid ea C1Y1Cheng etH siao)、云南黃連(Coptis teetaWall)的干燥根莖，在《神農本草經》中有很高的藥用價值，是植物藥材中的上品。根莖性質屬寒，味道較苦，對于調節人體心脾肝胃等器官有很大的良性作用，人們最常用黃連來去火，利用的就是它清心除煩、瀉火解毒的功效[1]。黃連含有的成分較為復雜，其中人們常用的就是黃連堿、非洲防己堿等，小檗堿在所有成分中含量最高，約為3%～9%[2]，藥理研究表明小檗堿具有顯著的抗腫瘤作用、對糖尿病、腸道、心血管均有作用，抗腦缺血，抗血小板、抗炎、抗腦缺血等作用[3～7]。目前小檗堿提取方法主要有滲漉法、有機溶劑法、浸漬法、水提取法、稀硫酸法[8]等。筆者采用回流提取法，不僅效率較高，可以減少提取過程投入的時間與人力投入，還可以深入研究鹽酸小檗堿的提取過程優劣之處，鹽酸小檗堿作為黃連的有效成分，研究過程應該重點完善其提取過程，通過改變影響提取的主要因素—溶劑濃度和提取時間來分別采用紫外分光光度計法[9]測定黃連中小檗堿的含量，優選最佳提取條件，給我國醫學領域黃連資源的開發制造更多助推力，提供更多具有較高價值的實驗依據。

1 材料和儀器

1.1 藥材與試劑

藥材: 目前，黃連飲片的供給方為商洛國藥控股企業，經商洛學院生物醫藥與食品工程學院制藥工程系鑒定為毛茛科植物黃連(Cop tisch inen sis Franch)的干燥根莖。

試劑：小檗堿標準品(批號 110713-201212，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇(利安隆博華(天津)醫藥化學有限公司)、無水乙醇(利安隆博華(天津)醫藥化學有限公司)、95%乙醇(利安隆博華(天津)醫藥化學有限公司)、鹽酸(西隴化工股份有限公司)。

1.2 實驗儀器

755B紫外可見光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；石英比色皿；電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠，型號HHS-11-2);索氏提取器；循環水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ))；移液管(0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL)、10 mL容量瓶若干、100 mL容量瓶若干、吸耳球、濾紙(9 cm)等。

2 實驗方法

2.1 不同條件黃連中小檗堿的提取

(1)精密稱取黃連粉末10 g，以濾紙包裹放進專業提取器里，常用的提取器為索氏提取器，量取無水乙醇與鹽酸比例為100∶1的溶劑100 mL置于250 mL的圓底燒瓶中，在80 ℃水浴鍋中回流提取，提取時間分別設定為1 h、2 h、3 h。

(2)精密稱取黃連粉末10 g，同上采取相同處理方法，量取95%乙醇與鹽酸比例為100∶1的溶劑100 mL置于250 mL的圓底燒瓶中，在80℃水浴鍋中回流提取，提取時間分別設定為1 h、2 h、3 h。

(3)精密稱取黃連粉末10 g，以濾紙包裹采用同上的相同處理方法，量取75%乙醇與鹽酸比例為100∶1的溶劑100 mL置于250 mL的圓底燒瓶中，在80℃水浴鍋中回流提取，提取時間分別設定為1 h、2 h、3 h。

2.2 含量測定方法

2.2.1 測定波長的選擇 將稱取量定為兩毫克，稱取對象為標準鹽酸小檗堿，將足量的鹽酸小檗堿放于容量瓶中，容量瓶量程為50 mL，采用水浴加熱的方法使鹽酸小檗堿充分溶解。放冷，加甲醇至刻度，以甲醇為空白溶液，波長范圍為300～600 nm，在該范圍內掃描溶液，掃描結果表明，當波長為345 nm時，溶液的吸收峰最大，因此選擇345 nm作為鹽酸小檗堿的測定波長。

2.2.2 制備鹽酸小檗堿標準品溶液 使用專業手法稱取標準鹽酸小檗堿，稱取質量為10 g，將稱取后的鹽酸小檗堿放于容量瓶里，容量瓶量程選為250 mL，同樣進行水浴加熱處理使得鹽酸小檗堿可以充分溶解，放冷，加甲醇至刻度，制成濃度為0.040 mg·mL-1的溶液，放置一旁作為備用品。用精密儀器從溶液中量取小劑量試劑，從1 mL到5 mL，將這五種劑量的溶液均放置在容量瓶中，容量瓶量程選為10 mL，用甲醇定容至刻度，待測。

2.2.3 標準曲線的繪制 精密量取已配置好濃度的標準溶液，空白對照溶液選擇甲醇溶液，測定當掃描波長為345 nm時送我的的吸光度。將測量結果繪制出函數曲線，縱坐標為吸光度，橫坐標為溶液濃度。

表1 鹽酸小檗堿的標準曲線

圖1 鹽酸小檗堿標準曲線

2.2.4 制備實驗所需供試品溶液 保證精確度的前提下，量取上述黃連提取液0.1 mL，放于容量瓶中，容量瓶量程選為100 mL，向容量瓶中添加甲醇直到溶液達到刻度線處，搖晃均勻。以無水乙醇1 h為起始，75%乙醇3 h為終止編號(1、2、3、4、5、6、7、8、9)。

2.2.5 供試品溶液的含量測定 精密量取一定量制備好的鹽酸小檗堿供試品溶液9份，將甲醇作為實驗的空白溶液，采用方法為紫外分光光度法，在345 nm波長處測定吸光度，并且將鹽酸小檗堿的含量計算出來。

計算方式：

A=49.993C+0.0289，含量M測=(C×V1×V2)/1000，W(%)=(M測/M稱)×100%(V1:提取液的體積；V2:吸取0.1mL溶液稀釋體積)

2.2.6 穩定性實驗 精密量取75%乙醇提取3 h的提取溶液0.1 mL，將其放于容量瓶里，容量瓶量程選取為100 mL，向容量瓶中添加甲醇，室溫避光放置，分別于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，將掃描波長控制在345 nm，測定此時的吸光度。測定結果如下，溶液吸光度大體上沒有改變，這說明供試品具有較強的穩定性。

表2 穩定性實驗

2.2.7 精密度實驗 精密量取已配好濃度為0.04 mg·mL-1的鹽酸小檗堿標品溶液4 mL，放于容量瓶中，容量瓶量程為10 mL，向容量瓶中添加甲醇溶液，直到溶液達到刻度線，將掃描波長控制在345 nm，測定此時溶液的吸光度。結果見表3，吸光度值基本無變化，說明儀器具有良好的精密度，實驗結果參考價值較高。

表3 精密度實驗

2.2.8 重現性實驗 精密稱量黃連粉末10 g 5份，以75%的乙醇為提取溶劑，提取3 h后取提取液，吸取提取液0.1 mL，分別放于五個容量瓶中，容量瓶量程均為100 mL，向容量瓶中添加甲醇溶液，直到溶液達到刻度線，將添加過甲醇溶液的容量瓶試劑作為實驗的空白對照，掃描波長控制在345 nm，測定此時溶液的吸光度，結果見表4，吸光度值無變化，表明此法重現性良好。

2.2.9 加樣回收率實驗 精密量取供試品75%乙醇3h提取液0.1mL，置于100 mL容量瓶中，分別加入濃度為0.04 mg·mL-1的鹽酸小檗堿標品溶液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL，添加甲醇溶液，直到平視時溶液達到刻度線位置，將量取的甲醇溶液作為實驗的空白對照溶液，將掃描波長控制在345 nm，測定此時的吸光度，根據測量結果計算出實驗回收率。結果見表5，表明該方法準確度高，可靠性強。

3 結果分析與討論

3.1 提取條件不同對鹽酸小檗堿在黃連成分中占比大小的影響結果

不同提取條件對黃連中鹽酸小檗堿含量的影響結果見表6和圖2。

由表6和圖2可以看出，75%的乙醇為提取溶劑，提取時間為3h時，提取的鹽酸小檗堿含量最高，達12.42%。三種不同濃度的乙醇溶劑提取，小檗堿含量從高到低順序依次為75%乙醇﹥95%乙醇﹥無水乙醇；不同提取時間進行提取，小檗堿含量從高到低順序依次為3h﹥2h﹥1h。

圖2提取條件不同對鹽酸小檗堿在黃連成分中占比的影響

3.2 分析與討論

3.2.1 黃連品種不同造成其含有的鹽酸小檗堿量的不同 根據前人[10,11]對不同品種黃連藥材的測定結果發現，黃連的細分種類不同，其含有的鹽酸小檗堿的量也不同，在已知的黃連中，云連中的鹽酸小檗堿含量排名第一，第二為雅連，鹽酸小檗堿含量最少的是味連，雖然云連中含量最高，但是云連的產量低，而味連的產量較高，因此在實驗中選擇味連作為實驗藥材。

3.2.2 選擇不同的提取溶劑給提取率帶來的影響 在溫度較高的純凈水或者溫度較高的乙醇溶液中，鹽酸小檗堿具有更高的溶解度，當溫度降低其溶解度也隨之減少，在實驗中，可以深入研究甲醇與乙醇的差別，選擇更合適的提取溶劑。甲醇具有毒性并且使用甲醇作為溶劑會增加成本投入，不僅保障不了安全性還會影響到其他實驗用品的選取，因此實驗的提取溶劑定為乙醇。

3.2.3 含量測定方法的選擇 鹽酸小檗堿的含量測定方法有多種[12]，采用紫外分光光度法相對于其他方法而言操作簡便，靈敏度高，結果可靠，將該方法用于測定鹽酸小檗堿在黃連中的占比，得出的結果具有較高參考價值。

4 結論

4.1 最佳提取條件的確定

提取條件為75%的乙醇溶液、提取時間為3h，鹽酸小檗堿含量最高，達12.42%，可作為黃連中小檗堿的最佳提取條件，亦為中藥黃連制劑生產提供實驗依據。

4.2 含量測定方法

在實驗中，提取鹽酸小檗堿的方法大多為乙醇回流法，因為該方法步驟簡單且提純率較高，通過紫外分光光度法在345 nm處測其吸光度值，能夠有效的計算出鹽酸小檗堿在黃連的所有成分中含量占比多少。此法簡便實用，結果可靠，可以給醫學領域開發黃連資源提供助推力，值得推廣。