酸浸超聲預處理輔助水酶法提取火麻籽油

王宇凡,張文斌*,徐琳娜

1(江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122) 3(蘇州市糧油質量監測所,江蘇 蘇州,215007)

火麻是桑科植物大麻(CannabissativaL.)一年生草本植物,又稱漢麻、線麻等[1]。火麻的葉子中富含大麻酚類物質,其中Δ9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC)具有致幻性和毒性[2],對人的中樞神經系統和心血管系統有不利影響,曾一度被限制種植和利用。現如今已培育出低含毒量的火麻品種,其中THC含量低于0.3%的被稱為工業大麻,已獲準合法種植。火麻擁有非常高的利用價值,火麻籽油、火麻蛋白以及大麻二酚(cannabidiol,CBD)等具有優秀的生理功能和營養價值受到研究者的廣泛關注[3],同時推動了全球工業火麻市場的增長。

火麻籽中約含有30%～50%的油脂,受種植氣候條件及種植地區不同的影響,品種之間存在一定的差異[4]。未脫殼火麻籽油是一種黃綠色油狀液體,經脫殼處理的火麻籽油呈現金黃色,具有特殊的火麻清香味[5]。火麻籽油富含不飽和脂肪酸,約占脂肪酸組成的90%,其中多不飽和脂肪酸含量約占70%[6]。火麻油中富含亞油酸和α-亞麻酸[7],分別占脂肪酸組成的 50%～70%和 15%～25%[8],具有抗炎癥、抗血栓形成、抗心律失常和降血脂等作用[9]。火麻籽油中n-6和n-3脂肪酸的比例約為3∶1,這種比例平衡在植物油中比較罕見,對人類健康最為有益[10]。此外,火麻籽油中生育酚和葉綠素較為豐富,其中γ-生育酚的含量最高,在油脂中有極強的抗氧化作用。火麻籽油被大量應用于烘焙及烹飪領域,是奶酪、甜點等的重要原料[11],此外還廣泛應用于化妝品等化工領域,具有廣闊的應用前景。

目前提取火麻籽油的主要方法是壓榨法和浸出法,壓榨法原理和設備簡單,缺點是提取效率低和副產物利用率低；浸出法提油效率較壓榨法顯著提升,但缺點是溶劑殘留率高,后續需要繁瑣的精煉工藝,總提取周期長。水媒法是一種新興高效的同時提取食用油和蛋白質的方法,又分為水代法、水酶法等[12],水媒法提取過程中能夠直接通過分離得到的油脂叫做清油或游離油。國內外目前僅有少數水酶法提取火麻籽油的報道。王歡等[13]采用水酶法提取火麻籽油,最終游離油得率達到51.09%。侯真真等[14]探究不同酶對水酶法提取火麻籽油的影響,最終通過響應面優化提油率達到75.64%。水代法與水酶法相比不使用大量酶制劑,大大降低生產成本,但是在油脂提取過程中會產生大量乳狀液,渣相殘留油脂比例高等問題限制了油脂的提取效率[15],因此水代法常常需要對原料進行預處理。常見的預處理方法主要有高溫蒸煮法、微波法和超聲波法等[16]。張偉光等[17]研究發現超聲處理顯著提高了冬瓜籽油得率,DICKEY等[18]研究發現玉米胚芽在酸性溶液中高溫蒸煮處理后可以顯著提高油脂得率。本實驗目的旨在通過研究對火麻籽仁的預處理,降低渣相殘油率與乳狀液含量的同時提高游離油得率,進一步提升水代法提取火麻籽油工藝的效率。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

脫殼火麻籽仁,產自云南巴馬；木瓜蛋白酶(9.1×104U/g),南寧龐博生物工程有限公司；中性蛋白酶7 L(8.5×104U/g),杰能科(中國)生物工程有限公司；枯草桿菌蛋白酶(15.7×104U/g)、堿性蛋白酶2.4 L(16.7×104U/g),諾維信(中國)生物技術有限公司；其余化學試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

DFY-500 搖擺式高速中藥粉碎機,浙江林大機械公司；LXJ-IIB 低速離心機,上海安亭儀器廠；SZC-101自動脂肪測定儀,上海纖檢儀器有限公司；KQ5200DE超聲清洗器,昆山市超聲儀器公司；精細研磨設備(實驗室自制)；84-1磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；Zeiss LSM 710激光共聚焦顯微鏡,德國卡爾蔡司；S3500激光粒度儀,美國Microtrac公司；MP-501A超級恒溫循環槽,上海一恒科學儀器有限公司；GC—2010型氣相色譜儀,日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預處理水代法提取火麻籽油工藝流程

預處理→干燥→火麻仁粗粉碎→精細粉碎→水代法提取→三相分離→乳狀液破乳→收集總油

1.2.2 火麻籽的預處理

超聲波處理：稱取火麻籽250 g,按料液比1∶1(g∶g)加入去離子水,在功率100 W條件下超聲處理1 h,然后于60 ℃烘箱中干燥至水分含量10%以下,干燥后的火麻籽置于通風處晾涼后裝于自封袋備用。

酸浸處理：稱取火麻籽250 g,按料液比1∶1(g∶g)加入 0.3 mol/L的檸檬酸溶液,在 25 ℃下攪拌混合浸泡6 h,然后做干燥處理,于60 ℃烘箱中干燥至水分含量10%以下。干燥后的火麻籽置于通風處晾涼后裝于自封袋備用。

酸浸超聲處理：稱取火麻籽250 g,按料液比1∶1(g∶g)加入 0.3 mol/L的檸檬酸溶液,置于功率100 W條件下超聲處理1 h,然后做干燥處理,于60 ℃烘箱中干燥至水分含量10%以下。干燥后的火麻籽置于通風處晾涼后裝于自封袋備用。

1.2.3 火麻籽的粉碎及粒徑的測定

選用高速中藥粉碎機對預處理完畢的火麻籽進行剪切粉碎,每次30 s,共粉碎3次。經過高速中藥粉碎機處理后的樣品再使用實驗室精細研磨設備粉碎處理5～7次,得到精細粉碎的火麻籽漿料。

取0.5 g 粉碎完成的火麻籽樣品,加入裝有10 mL丙酮的50 mL離心管中,漩渦振蕩1 min后,置于4 ℃冰箱中靜置2 h,離心后去除丙酮,沉淀用去離子水復溶后,使用激光粒度儀進行粒徑的測定。

1.2.4 火麻籽的激光共聚焦顯微鏡分析

首先對火麻籽進行激光共聚焦顯微鏡觀察前的固定處理。用2%戊二醛-多聚甲醛溶液固定24 h,然后用0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)沖洗3次。使用OOCT包埋機包埋亞麻籽仁,并置于-80 ℃冰箱加固。使用冷凍切片機將其切成16 μm的薄片,置于載玻片上,依此使用尼羅紅和異硫氰酸熒光素進行避光染色,分別使用10×和20×的物鏡進行觀察和圖像采集。

1.2.5 水代法提取中油脂殘留率的測定

水相中油脂的測定：取水相10 g于毛氏管中,加入1.5 mL氨水后再加入10 mL乙醇、25 mL乙醚和25 mL石油醚,靜置分層,將有機相置于圓底燒瓶。重復上述步驟2次。將收集完成后的圓底燒瓶置于85 ℃水浴中蒸干,之后于105 ℃烘箱中干燥至恒重。

渣相中油脂的測定：收集渣相于105 ℃烘箱中干燥,然后用粉碎機研磨成粉狀,取2 g左右樣品于自動索氏抽提器中測定脂肪含量。程序完畢后取出索氏盒烘干至恒重。

火麻籽總油脂含量按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中方法測定。

水相殘油率/%=(水相油脂含量/總油脂含量)×100

(1)

渣相殘油率/%=(渣相油脂含量/總油脂含量)×100

(2)

油脂殘留率/%=水相殘油率+渣相殘油率

(3)

1.2.6 水代法工藝條件的優化

稱取100 g火麻籽漿料于夾套反應器中,按料液比1∶4(g∶g)加入去離子水,調節恒溫循環槽溫度至60 ℃,用稀釋后的NaOH溶液調節pH至9.0,反應2 h后離心(5000×g,15 min),分離出油相、乳狀液、水相和渣相。

通過料液比、提取pH、溫度和提取時間的單因素實驗對水代法的工藝進行優化。

1.2.6.1 料液比

參考上述方法,具體步驟有所調整。固定其他條件不變,探究不同料液比(g∶g)(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)對油脂在各相分布及殘油率的影響,綜合確定最佳料液比。

1.2.6.2 pH

參考上述方法,具體步驟有所調整。固定其他條件不變,探究不同pH(8、9、10、11、12)對油脂在各相分布及殘油率的影響,綜合確定最佳pH。

1.2.6.3 提取溫度

參考上述方法,具體步驟有所調整。固定其他條件不變,探究不同提取溫度(40、50、60、70 ℃)對油脂在各相分布及殘油率的影響,綜合確定最佳提取溫度。

1.2.6.4 提取時間

參考上述方法,具體步驟有所調整。固定其他條件不變,探究不同提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)對油脂在各相分布及殘油率的影響,綜合確定最佳提取時間。

1.2.7 酶法破乳

冷凍解凍破乳：在-18 ℃冷凍24 h,40 ℃條件下解凍1 h,5 000 r/min離心15 min,取上層清油根據公式(4)計算破乳率。

酶法破乳：取一定量的乳狀液加入夾套反應器里進行反應,分別添加不同的酶,在酶對應的最適溫度和pH條件下進行酶解反應2 h。反應結束后,5 000 r/min 離心15 min，取上層清油根據公式(4)計算破乳率。

(4)

1.2.8 火麻籽油品質分析

火麻籽油的酸價根據GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》中方法測定；過氧化值根據GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中方法測定；碘值根據GB/T 5532—2008《動植物油脂 碘值的測定》中方法測定；水分及揮發物根據GB 5009.236—2016《食品安全國家標準 動植物油脂水分及揮發物的測定》中方法測定。氧化穩定性根據GB/T 21121—2007《動植物油脂 氧化穩定性的測定(加速氧化測試)》測定。亞麻籽油脂肪酸組成的測定按照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》中方法。

1.2.9 數據處理

所有結果均以平均值±標準偏差(SD)表示,所有樣品均做3次平行實驗。用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 預處理方式對水代法提取火麻籽油的影響

不同預處理條件對水代法提取火麻籽油的影響如圖1所示。未處理火麻籽經水代法提取后清油得率僅有47.41%,乳狀液中油脂含量高達40.61%,由此可見直接進行水代法提取會導致清油得率偏低,后續處理繁瑣等問題。對火麻籽單獨進行超聲波處理和酸液浸泡處理后,清油得率分別上升到65.22%和77.48%,乳狀液中油脂含量下降至28.25%和15.36%。ZHANG等[19]研究了酸浸預處理對亞麻籽水代法提油的影響,發現可以顯著提高清油得率,與本實驗結果一致。對火麻籽進行酸浸-超聲的復合處理后,清油得率進一步提高至82.23%,不僅乳狀液中油脂含量下降至12.30%,渣相殘油率也從單一酸浸處理的4.23%下降至2.14%。HUANG等[20]研究大豆分離蛋白時發現,單獨酸處理時,其溶解性顯著下降；而酸超聲復合處理時,其溶解度無明顯變化,且證實了較大的聚集蛋白在超聲和酸的聯合作用下發生較大程度的解離。由此推測可能是由于超聲和酸的協同作用導致了火麻籽蛋白結構的改變,從而減少了乳狀液的形成。

圖1 預處理方式對水代法提取火麻籽油的影響Fig.1 Effect of pretreatment methods on extraction of hemp seed oil by AEP

2.2 預處理對粉碎頻次及粒徑的影響

粒徑的大小對水媒法提取食用油技術至關重要。ROSENTHAL等[21]研究發現物料的破碎程度與水代法提取油脂的效率成正相關。粉碎過程會破除植物細胞的細胞壁并釋放出油脂,粒徑的大小將直接影響水媒法的提油效率。圖2為不同預處理方式對粉碎頻次及粒徑的影響,可以看出未處理組火麻籽經3次剪切粉碎和7次精細粉碎后粒徑為27.81 μm。經過預處理后,火麻籽的粒徑都有不同程度的減小。其中酸浸-超聲預處理組經過3次剪切粉碎和7次精細粉碎,最終平均粒徑約為12.13 μm。推測可能是由于超聲波處理破壞了火麻籽細胞的完整性,讓細胞壁更容易分解,同時加快了酸的傳質使其更快到達細胞內部。

圖2 粉碎方式與頻次對火麻籽平均粒徑的影響Fig.2 Effect of crushing mode and frequency on average particle size of hempseed 注：A1～A3表示剪切粉碎及次數,B1～B7表示精細粉碎及次數

2.3 酸浸超聲預處理對火麻籽微觀結構的影響

圖3為酸浸超聲預處理前后火麻籽的激光共聚焦顯微照片。未處理的火麻籽細胞輪廓清晰可見,蛋白體大量聚集并包裹油脂體,油脂體散亂分布。經過酸浸超聲預處理后,火麻籽細胞結構遭到一定程度的破壞,油脂體大量聚集,蛋白體顆粒變小且散亂分布于聚集的油脂體中,蛋白結構的變化可能導致不易與油脂形成乳狀液。激光共聚焦結果結合粒徑分析表明,酸浸超聲復合預處理對水代法提取火麻籽油有顯著的促進作用。

a-未處理火麻籽；b-酸浸超聲預處理火麻籽注：O-油脂體；P-蛋白體圖3 火麻籽酸浸超聲預處理前后激光共聚焦顯微圖像Fig.3 Confocal micrograph of hempseed after pretreatments

2.4 超聲輔助水代法工藝優化

通過預處理的預實驗和粉碎結果的表征,酸浸超聲預處理能夠顯著改善水代法的提油效率。因此,選用酸浸超聲預處理的火麻籽原料,針對水代法工藝條件中提取pH、料液比、提取溫度和提取時間進行工藝優化。

2.4.1 pH值

pH對水代法提取火麻籽油的影響見圖4。pH的變化對火麻籽油的提取影響較大,MCNUTT等[22]研究發現pH值影響了植物蛋白在各相的分布,進而影響油脂的提取效率。pH值由8增加到12,清油得率先增大再減小,同時油脂殘留率先減小后增大。當pH為10時,清油得率最高為83.61%,油脂殘留率最低為4.53%。綜上,確定超聲輔助水代法提取火麻籽油的最佳pH值為10。

圖4 pH對水代法提取火麻籽油的影響Fig.4 Effect of pH on extraction of hempseed oil by AEP

2.4.2 料液比

料液比對水代法提取火麻籽油的影響見圖5。在低料液比條件下,料液比對油脂殘留率和油相比例影響顯著,清油得率隨料液比的增加而提高,油脂殘留率逐漸減少,這可能是由于低料液比的情況下反應體系黏稠,漿料與水接觸不完全導致油脂不能被完全提取。

圖5 料液比對水代法提取火麻籽油的影響Fig.5 Effect of hempseed to water ratio on extraction of hempseed oil by AEP

當料液比為1∶3(g∶g)時清油得率達到高水平,為82.16%,同時油脂殘留率為5.00%。當料液比繼續提高,對清油得率和油脂殘留率影響不顯著。因此在考慮成本和效率的前提下,選擇1∶3的料液比作為水代法的反應條件。

2.4.3 提取時間

提取時間對水代法提取火麻籽油的影響見圖6。隨著提取時間的增長,清油得率先增加后減少,這可能是由于長時間反應使水相中蛋白和油脂結合的幾率增大,進而導致乳狀液的生成。當提取時間為1.5 h時,清油得率達到最高為83.62%,油脂殘留率為4.12%。盡管反應2.5 h后,油脂殘留率下降至3.40%,相比1.5 h下降了0.72%左右,但是清油得率也下降了約5.5%。考慮到工藝時間成本和整體效率,選擇反應時間1.5 h作為合適的提取時間。

圖6 提取時間對水代法提取火麻籽油的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction of hempseed oil by AEP

2.4.4 提取溫度

提取溫度對水代法提取火麻籽油的影響見圖7。當提取溫度小于60 ℃時,隨著溫度的上升油脂殘留率逐漸降低,同時清油得率顯著提高,60 ℃時清油得率為83.62%,油脂殘留率為3.84%。這可能是由于溫度升高導致分子運動加劇,油脂能夠更好地從體系中游離出來,不易形成乳狀液。

圖7 提取溫度對水代法提取火麻籽油的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on extraction of hempseed oil by AEP

溫度繼續升高至70 ℃后,清油得率顯著下降至78.64%,推測可能是溫度過高導致部分蛋白性質的改變。綜合考慮,確定水代法的最適提取溫度為60 ℃。

2.4.5 乳狀液的破除

選擇冷凍解凍破乳和4種不同的酶法破乳,破乳率如圖8所示。其中,破乳率較高的是枯草桿菌蛋白酶和冷凍解凍破乳,破乳率分別為98.34%和96.05%。考慮到枯草桿菌蛋白酶適宜偏堿性的條件,破乳時無需調節pH,而冷凍解凍破乳耗時長、成本高,綜合考慮選擇枯草桿菌蛋白酶進行破乳。

1-枯草桿菌蛋白酶;2-冷凍破乳;3-木瓜蛋白酶;4-堿性蛋白酶2709;5-中性蛋白酶7L圖8 不同處理對乳狀液破除的影響Fig.8 Demulsification rate of emulsion with different treatments

2.4.6 最佳工藝驗證

綜上,最佳工藝條件為：料液比1∶3(g∶g),pH值10.0,提取溫度60 ℃,提取時間1.5 h。所得乳狀液使用枯草桿菌蛋白酶破乳。進行3次平行實驗,最終總油得率為(95.36±0.73)%。證明本實驗所采用的酸浸超聲輔助水代法提取火麻籽油具有一定的可行性。

2.5 火麻籽油品質分析

2.5.1 火麻籽油基本品質指標

比較了市售壓榨火麻籽油以及預處理前后水代法提取火麻籽油的基本指標。實驗結果表明,市售壓榨火麻籽油和預處理前后水代法提取火麻籽油的碘值、揮發性成分和氧化誘導時間無顯著性差異。

表1 預處理對火麻籽油基本理化指標的影響Table 1 Effects of pretreatments on basic physicochemical indexes of hempseed oil

過氧化值是評判油脂被氧化程度的指標,酸浸超聲輔助水代法全程條件溫和,其過氧化值為2.26 mmol/kg,顯著低于市售壓榨火麻籽油(3.12 mmol/kg)。所有指標均符合國家食用油標準,表明酸浸超聲輔助水代法提取的火麻籽油品質較好,具有一定的應用價值。

2.5.2 火麻籽油脂肪酸分析

預處理對火麻籽油脂肪酸組成的影響如表2所示。各預處理組與對照組間的脂肪酸組成均無顯著性差異,表明酸浸超聲預處理對火麻籽油脂肪酸組成無明顯影響。PORTO等[23]研究了超臨界萃取法對火麻籽油的影響,脂肪酸組成與本實驗基本一致。經酸浸超聲預處理后,火麻籽油中不飽和脂肪酸含量約占90%,其中多不飽和脂肪酸占78.24%。

表2 不同預處理對火麻籽油脂肪酸組成的影響 單位：%

3 結論

酸浸超聲協同預處理后的火麻籽,經過3次剪切粉碎和7次精細粉碎后平均粒徑減小到12.13 μm,表明酸浸超聲預處理對火麻籽的細胞結構造成了一定的破壞。結合激光共聚焦顯微鏡照片結果分析,原本聚集的蛋白體變得散亂,且蛋白體顆粒變小,油脂體大量聚集,可以推測火麻籽蛋白的部分結構發生了改變。

酸浸超聲預處理對水代法提取火麻籽油影響顯著,清油得率進一步提高至82.23%,乳狀液中油脂含量下降至12.30%,渣相殘油率也從單一酸浸處理的4.23%下降至2.14%。

對水代法進行工藝優化的結果為：料液比1∶3(g∶g),pH值10.0,提取溫度60 ℃,提取時間1.5 h。所得乳狀液使用枯草桿菌蛋白酶破乳,破乳率可達到98.34%。經最佳工藝多次驗證,最終總油得率可達到(95.36±0.73)%。

對酸浸超聲輔助水代法所提取的火麻籽油進行品質分析,結果表明火麻籽油品質良好,符合國家標準；脂肪酸組成與對照組無明顯差異。說明該工藝具有一定的應用與研究價值。