高產(chǎn)酯酵母的篩選、鑒定及其發(fā)酵特性研究

劉薇,欒春光,王德良*,姜欣

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊,830052) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100015)

老陳醋是一種以大曲為發(fā)酵劑經(jīng)自然固態(tài)發(fā)酵的傳統(tǒng)發(fā)酵食品,是我國四大名醋之一。獨特的釀造工藝賦予了老陳醋醇、香、綿、柔的風(fēng)味與口感[1-2]。老陳醋的香氣是評價其質(zhì)量的重要依據(jù)[3],主要依靠不同種類的物質(zhì)協(xié)同實現(xiàn)[4]。其中,香氣濃郁的酯類物質(zhì)在老陳醋獨特香氣形成中發(fā)揮了重要的作用[5]。在老陳醋所包含的酯類物質(zhì)中,乙酸乙酯所占比例最高,占香氣成分的60%以上[6]。因此,如何提高老陳醋中乙酸乙酯的含量對于進一步提升老陳醋的質(zhì)量至關(guān)重要。在老陳醋的發(fā)酵過程中,乙酸乙酯主要來源于產(chǎn)酯酵母的代謝[7],這類酵母能夠在生長過程中利用葡萄糖為底物代謝產(chǎn)生乙醇、乙酸,并在自身酯化酶的催化作用下合成乙酸乙酯[8]。因此,篩選高產(chǎn)酯酵母也就成為了科研工作的重點研究之一。

我國科研工作者在篩選高產(chǎn)酯酵母上做了大量的工作。陳嘉等[9]從山西老陳醋發(fā)酵過程的酒醅中分離篩選產(chǎn)酯酵母,得到的3株產(chǎn)酯酵母中,1株畢赤酵母Y14與大曲混合發(fā)酵后,釀制的老陳醋乙酸乙酯含量較對照組提高了1.3倍。董凱鋒等[10]從水塔老陳醋大曲中分離得到1株產(chǎn)乙酸乙酯的異常威克漢姆酵母m12,其乙酸乙酯產(chǎn)量可以達(dá)到4.441 5 g/L。張杰等[11]從清香型小曲中篩選高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌,得到1株異常畢赤酵母Y7,將其應(yīng)用于清香型白酒的發(fā)酵中,其產(chǎn)乙酸乙酯含量為2.86 g/L,是傳統(tǒng)工藝釀造清香型白酒乙酸乙酯含量的1.5倍。目前對高產(chǎn)酯酵母篩選及功能特性的研究,雖然在一定程度上提高了乙酸乙酯的產(chǎn)量,但仍然無法滿足實際生產(chǎn)應(yīng)用的需求。

本研究以通過來自不同食醋企業(yè)、白酒企業(yè)的醋醅、酒曲樣品為分離源,以篩選具有高產(chǎn)乙酸乙酯性能的酵母菌株為目的,研究其發(fā)酵相關(guān)功能特性。同時,對其產(chǎn)酯條件進行優(yōu)化,旨在為產(chǎn)酯酵母的工業(yè)化生產(chǎn)提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

樣品來源：山西多家食醋企業(yè)提供的醋醅、大曲樣品；四川白酒企業(yè)提供的酒曲和酒醅樣品。

酵母浸出粉、蛋白胨、葡萄糖、孟加拉紅培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉,Biotopped；無水乙醇,天津市大茂化學(xué)試劑廠；山梨醇,浙江凱維嘉生物科技有限公司；酵母基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司；酵母菌PCR通用引物NL1和NL4、10×PCR buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、6×Loading Buffer,生工生物工程(上海)股份有限公司；安琪生香活性干酵母，湖北宜昌安琪酵母股份有限公司。

YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉 10.0，蛋白胨 20.0，葡萄糖 20.0，115℃滅菌30 min；

YPD固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉 10.0，蛋白胨 20.0，葡萄糖 20.0，瓊脂粉 20.0，115℃滅菌30 min；

孟加拉紅培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 5.0，KH2PO41.0，MgSO40.5，葡萄糖 10.0，氯霉素 0.1，孟加拉紅 0.033，瓊脂 20.0，121℃滅菌20 min；

產(chǎn)酯培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖80.0，115 ℃滅菌30 min。

高粱汁培養(yǎng)基[12]：100 g高粱粉碎后加入800 mL蒸餾水煮沸1 h,適溫加入糖化酶與β-淀粉酶,于60 ℃水浴2～4 h,將過濾得到的濾液糖度調(diào)整為7°Brix。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平,梅特勒-托利多公司；微量移液槍,RAININ公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器,美國Scientific Industries有限公司；高速微量離心機,湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；Biosystems Model溫度梯度PCR儀、Tanon1600凝膠成像儀,美國伯樂公司；BG-Power600電泳儀,北京百晶生物技術(shù)有限公司；雙人單面超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司；Auto System XL氣相色譜儀；CP-Wax 57CB毛細(xì)管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm),美國Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離純化

稱取10 g樣品(大曲、醋醅或酒醅)置于裝有90 mL無菌蒸餾水的三角瓶中,28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。吸取菌懸液1 mL于9 mL無菌蒸餾水中,并依次進行梯度稀釋,配制成稀釋倍數(shù)為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液。分別取100 μL稀釋倍數(shù)為10-4、10-5和10-6的菌懸液均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基上,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d[13-14]。挑取具有典型酵母菌落特征的單菌落于YPD固體培養(yǎng)基上劃線分離純化。將具有酵母菌特性的菌株轉(zhuǎn)接于YPD斜面培養(yǎng)基中,于4 ℃進行保存?zhèn)溆肹15]。

1.2.2 酵母菌株形態(tài)學(xué)鑒定

挑取保存于斜面培養(yǎng)基上的菌株,接種于YPD固體培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d活化,觀察菌落形態(tài)。同時,取少量菌體用于顯微鏡下鏡檢觀察[16]。

1.2.3 酵母菌株分子鑒定

取1 mL活化的酵母菌液,離心收集菌體,收集到的菌體經(jīng)磷酸緩沖液清洗。然后,利用酵母基因組提取試劑盒提取酵母菌基因組DNA,提取的基因組DNA質(zhì)量通過核酸蛋白測定儀ND-1000進行檢測。研究中以分離的不同酵母基因組DNA為模板,以NL1和NL4為引物[17],擴增26S rDNA目標(biāo)基因?qū)湍妇赀M行分子鑒定。用于擴增的PCR反應(yīng)體系如下(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL；dNTP 2.0 μL,TaqDNA聚合酶0.3 μL,引物各1.0 μL；DNA模板1.0 μL；ddH2O 17.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min；35次循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對分析。

1.2.4 酵母菌株產(chǎn)乙酸乙酯能力測定

挑取保存的酵母菌株于YPD液體培養(yǎng)基中,于28 ℃、150 r/min活化24 h。然后以10%的接種量接種于100 mL 7°Brix高粱汁培養(yǎng)基中,于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)5 d[18]。將酵母菌液再分別接種于產(chǎn)酯培養(yǎng)基和添加少量乙醇、乙酸的高粱汁培養(yǎng)基中,以同樣的培養(yǎng)條件進行復(fù)篩。利用Auto System XL氣相色譜儀對發(fā)酵液中的乙酸乙酯含量進行測定。分析條件：CP-Wax 57CB毛細(xì)管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)；起始溫度30 ℃,恒溫5 min,以5 ℃/min程序升溫至60 ℃,以6 ℃/min程序升溫至120 ℃,恒溫5 min,以8 ℃/min程序升溫至210 ℃,恒溫5 min；載氣(高純氮)：流速1 mL/min,分流比為10∶1；氫氣：流速為45 mL/min；空氣：流速為450 mL/min；檢測器溫度：260 ℃；進樣器溫度：240 ℃；進樣量：1 μL。

1.2.5 篩選菌株發(fā)酵相關(guān)特性研究

本研究從葡萄糖[19]、乙醇[20]、pH[21]、溫度[22]耐受性4個方面考察酵母菌株的發(fā)酵相關(guān)特性。將活化的酵母菌液以2%的接種量分別接種于不同條件的YPD液體培養(yǎng)基中,置于搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)好的菌液于620 nm處測量其OD值。葡萄糖質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為100、200、300、400、500 g/L；乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度設(shè)置為6%、8%、10%、12%、14%；pH(用1 mol/L的鹽酸進行調(diào)節(jié))梯度設(shè)置為1.5、2、2.5、3、4；溫度梯度設(shè)置為34、36、38、40和42 ℃。

1.2.6 酵母菌株產(chǎn)乙酸乙酯條件的研究

1.2.6.1 單因素發(fā)酵條件對乙酸乙酯產(chǎn)量的影響研究

為了探究葡萄糖濃度、溫度、pH、發(fā)酵時間以及乙醇含量在發(fā)酵過程中對乙酸乙酯產(chǎn)量的影響,研究中將篩選出的酵母菌株按照不同發(fā)酵條件接種于高粱汁培養(yǎng)基中,于搖床中振蕩培養(yǎng),通過檢測乙酸乙酯的含量來確定各個單因素的最佳條件范圍[23-24]。培養(yǎng)基的pH值用1 mol/L的鹽酸進行調(diào)節(jié),乙酸乙酯的檢測方法同1.2.4。

1.2.6.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,結(jié)合實際發(fā)酵情況,選取溫度、pH值、乙醇含量(體積分?jǐn)?shù))3個因素,采用3因素3水平正交試驗[25-27]來進一步考察對乙酸乙酯產(chǎn)量的影響,正交條件如表1所示。

表1 酵母產(chǎn)乙酸乙酯3因素3水平正交條件表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for the production of ethyl acetate

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Origin及SPSS Statistics 26軟件進行分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的篩選與鑒定

結(jié)合菌落形態(tài)特征以及菌株鏡檢觀察的結(jié)果,從醋醅和酒醅中初步篩選得到了14株菌株,編號為Y1～Y14,典型菌株平板劃線圖及鏡檢圖見圖1。篩選的酵母菌株菌落形態(tài)多為圓形,表面光滑、呈乳白色,部分表面有絨毛、呈奶油色。顯微鏡鏡檢結(jié)果表明,在40倍放大的條件下觀察得到的酵母細(xì)胞形狀為圓形、卵圓形及橢圓形。

a-Y10平板圖;b-Y10平板圖;c-Y12平板圖;d-Y12平板圖圖1 菌株Y10、Y12平板劃線圖及鏡檢圖Fig.1 Strain Y10,Y12 plate and microscopic images

在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上,對所篩選出的14株菌進一步進行分子水平鑒定。PCR擴增26S rDNA產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。擴增得到的片段大小在600 bp左右,符合目的產(chǎn)物要求。

圖2 不同菌株26S rDNA PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 26S rDNA of different strains

將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對,比對結(jié)果如表2。鑒定結(jié)果表明,14株酵母菌株中有9株葡萄牙棒孢酵母,2株異常威克漢姆酵母和3株畢赤酵母。

表2 酵母菌株26S rDNA鑒定結(jié)果Table 2 Identification of yeast strains by 26S rDNA

2.2 酵母菌株產(chǎn)乙酸乙酯能力測定

利用高粱汁作為發(fā)酵培養(yǎng)基,對篩選得到的14株酵母菌株進行產(chǎn)乙酸乙酯能力的測定,檢測結(jié)果見表3。14株酵母菌株產(chǎn)乙酸乙酯的能力具有顯著差異。其中菌株Y10和Y12表現(xiàn)出較強的產(chǎn)乙酸乙酯能力,乙酸乙酯含量分別達(dá)到了6.68和4.73 g/L。其他菌株雖有產(chǎn)乙酸乙酯的能力,但均弱于Y10和Y12。因此,選用Y10和Y12這2株菌進行后續(xù)的發(fā)酵性能測試。

表3 不同菌株產(chǎn)乙酸乙酯情況Table 3 Ethyl acetate production by different strains

為探究菌株Y10和Y12產(chǎn)乙酸乙酯能力的穩(wěn)定性,選用產(chǎn)酯培養(yǎng)基和不同成分高粱汁培養(yǎng)基進行復(fù)測(表4)。結(jié)果表明,菌株Y10和Y12在這2種培養(yǎng)基中也均表現(xiàn)出了較高的產(chǎn)乙酸乙酯能力,在添加少量乙醇、乙酸的高粱汁培養(yǎng)基中,2株菌的乙酸乙酯產(chǎn)量分別達(dá)到了9.01和7.05 g/L。在產(chǎn)酯培養(yǎng)基中,雖然乙酸乙酯產(chǎn)量較普通高粱汁培養(yǎng)基略有降低,但2株菌株依舊表現(xiàn)出了較高的產(chǎn)乙酸乙酯能力,并分別達(dá)到了4.56和3.51 g/L。且與對照菌株(市售某知名產(chǎn)酯酵母)相比較,這2株酵母產(chǎn)乙酸乙酯能力均具有相對優(yōu)勢。

表4 不同培養(yǎng)基菌株產(chǎn)乙酸乙酯情況 單位：g/L

2.3 酵母菌株發(fā)酵相關(guān)特性研究

發(fā)酵過程中隨著糖化的進行,發(fā)酵液的糖度也在不斷升高,這使整個發(fā)酵環(huán)境的滲透壓被改變,從而對菌株的正常生長代謝和繁殖造成影響。為此,研究中首先考察不同葡萄糖濃度對菌株生長的影響。結(jié)果如圖3-a所示,當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖含量不斷增加時,菌株的活性在不斷降低,當(dāng)葡萄糖含量高于300 g/L時,酵母菌Y10、Y12以及對照菌株(市售某知名產(chǎn)酯酵母)的生長均受到了不同程度的抑制。其中,Y12表現(xiàn)出了最強的葡萄糖濃度耐受性,即在3株酵母中Y12具有最強的耐高滲能力。

乙醇是酵母菌發(fā)酵的產(chǎn)物,酵母菌可利用乙醇和乙酸在酶的作用下合成乙酸乙酯[28],發(fā)酵過程中不斷累積的乙醇濃度會對酵母菌的生長產(chǎn)生抑制作用。菌株的乙醇耐受性檢測結(jié)果如圖3-b所示。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于10%時,被測酵母菌株均生長良好,同時,Y10和Y12對乙醇的耐受性整體優(yōu)于對照菌株。

在發(fā)酵過程中,乳酸菌和醋酸菌等代謝會產(chǎn)生一定的乳酸和醋酸,導(dǎo)致發(fā)酵體系的pH值降低。因此具有良好的酸耐受性也是優(yōu)良酵母菌株應(yīng)具備的生物學(xué)性質(zhì)之一。在圖3-c中可見,菌株Y10與Y12即使在pH為3～4時仍然生長良好,而且,Y12在pH為2.5時也表現(xiàn)出了較好的活性,其酸耐受性明顯優(yōu)于參考菌株,說明菌株具有良好的環(huán)境適應(yīng)性。

a-葡萄糖質(zhì)量濃度；b-乙醇體積分?jǐn)?shù)；c- pH；d-溫度圖3 不同條件下酵母菌株的生長情況Fig.3 Growth of yeasts strains at different conditions

除了以上3個條件外,溫度也是影響微生物生長代謝的重要因素之一,過高的溫度會影響微生物中酶的活性,從而減少代謝產(chǎn)物的生成。菌株的溫度耐受性結(jié)果如圖3-d所示,當(dāng)溫度逐漸升高時,菌株的活性在不斷降低,菌株的生長受到了明顯的抑制。當(dāng)溫度為36 ℃時,Y10和Y12尚能表現(xiàn)出較好的生存活力,表明兩菌株對高溫具有較好的耐受性。

2.4 單因素發(fā)酵條件對酵母菌株產(chǎn)乙酸乙酯能力的影響

在考察了菌株的基本發(fā)酵特性后,本研究從5個因素,包括葡萄糖濃度(6～12 °Brix)、溫度(24～30 ℃)、pH值(2～6)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(0～8%)和發(fā)酵時間(3～7 d),對篩選到的2株高產(chǎn)乙酸乙酯菌株的發(fā)酵條件做了進一步研究,用以了解單因素發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酯能力的影響。如圖4-a所示,當(dāng)糖度為8°Brix時,菌株Y10和Y12的乙酸乙酯產(chǎn)量最高,分別達(dá)到2.47和1.62 g/L。研究中隨著糖度的升高,發(fā)酵環(huán)境的滲透壓也在逐漸增大,而較高的滲透壓破壞了酵母菌的細(xì)胞形態(tài),從而影響了菌株的生長代謝,并最終導(dǎo)致菌株產(chǎn)乙酸乙酯能力降低[29]。在考察溫度對酵母菌產(chǎn)乙酸乙酯能力的影響時發(fā)現(xiàn)(圖4-b),菌株Y10與Y12的乙酸乙酯產(chǎn)量隨著溫度升高也呈現(xiàn)明顯的下降趨勢,這可能是因為,過高的溫度會引起菌株內(nèi)相關(guān)酶活性的下降,并促進酵母體內(nèi)合成較多的熱激蛋白,而乙酸乙酯的產(chǎn)量也相對減少[30]。在24 ℃時產(chǎn)量最高,2株菌的產(chǎn)酯能力分別達(dá)到9.59和7.47 g/L。因此,過高的糖度和溫度均可導(dǎo)致乙酸乙酯產(chǎn)量的下降。

a-糖度；b-溫度；c- pH；d-乙醇體積分?jǐn)?shù)；e-發(fā)酵時間圖4 單因素發(fā)酵條件對酵母菌株乙酸乙酯產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different fermentation conditions on yield of ethyl acetate

pH值和乙醇含量也在不同程度上影響著酵母菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量。如圖4-c所示,當(dāng)pH為4時,Y10和Y12的乙酸乙酯產(chǎn)量均達(dá)到最高值,分別為3.87和5.62 g/L。當(dāng)pH值偏高或偏低時,對菌株的生長代謝均有明顯的抑制。同樣,在考察乙醇對菌株乙酸乙酯產(chǎn)量的影響時發(fā)現(xiàn),乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時Y10和Y12的乙酸乙酯產(chǎn)量分別達(dá)到了7.26和8.86 g/L(圖4-d)。陳醋發(fā)酵過程中,乙醇量在發(fā)酵前期是逐漸積累和增加的。高濃度的乙醇會對酵母細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒害效應(yīng)[31],同時也會促進酵母細(xì)胞體內(nèi)海藻糖代謝增加來提升其乙醇耐受性[32],從而可能減弱了酵母菌自身利用乙醇產(chǎn)乙酸乙酯的能力。

發(fā)酵時間也是控制酵母菌株乙酸乙酯產(chǎn)量的重要因素之一。圖4-e表明,在發(fā)酵第4天,Y10和Y12兩株菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量均達(dá)到最高,分別為1.264和1.21 g/L。發(fā)酵時間過短會導(dǎo)致發(fā)酵不足,乙酸乙酯的產(chǎn)量降低；而發(fā)酵時間過長菌株活力有所下降,加之乙酸乙酯的揮發(fā)量的增加,都會導(dǎo)致乙酸乙酯的產(chǎn)量的減少[33]。

2.5 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果并結(jié)合實際發(fā)酵情況,進一步對菌株產(chǎn)乙酸乙酯能力影響較大的3個主要因素,包括溫度、pH、乙醇含量,進行正交試驗,以確定菌株Y10和Y12產(chǎn)乙酸乙酯的最優(yōu)生產(chǎn)條件。結(jié)果如表5、表6所示,在A(溫度)、B(pH值)、C(乙醇濃度)3個影響因素中乙醇體積分?jǐn)?shù)對乙酸乙酯的產(chǎn)量影響程度最大,3個因素的影響程度由高到低排序為C>A>B。根據(jù)試驗結(jié)果綜合分析,最優(yōu)組合為A3B3C2,即在28 ℃、pH 6,乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%的條件下,菌株Y10和Y12的乙酸乙酯產(chǎn)量最高,分別能夠達(dá)到13.18和12.92 g/L,相比于優(yōu)化前分別顯著提高了4.17和5.87 g/L。

表5 Y10產(chǎn)乙酸乙酯條件正交實驗結(jié)果Table 5 Orthogonal experiment results of Y10 for the production of ethyl acetate

3 結(jié)論

從工業(yè)化醋醅、酒醅樣品中分離得到了14株酵母菌株,分別進行產(chǎn)乙酸乙酯能力的測定。其中2株酵母菌株Y10和Y12表現(xiàn)出了較高的產(chǎn)乙酸乙酯能力,產(chǎn)量分別達(dá)到了6.68和4.73 g/L,經(jīng)鑒定2株酵母均為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。結(jié)果表明,異常威克漢姆酵母Y10和Y12對發(fā)酵環(huán)境中的葡萄糖、酸、乙醇和溫度的變化均具有良好的耐受性。當(dāng)發(fā)酵條件為：pH 6、乙醇體積分?jǐn)?shù)2%、溫度28 ℃時,菌株Y10和Y12乙酸乙酯的產(chǎn)量最高,分別能夠達(dá)到13.18和12.92 g/L。相比優(yōu)化前,2株酵母的產(chǎn)酯能力分別顯著提高了4.17和5.87 g/L。異常威克漢姆酵母Y10和Y12具有較高的產(chǎn)乙酸乙酯能力,具有較強的實際應(yīng)用潛力。