高產酯酵母的篩選、鑒定及其發酵特性研究

劉薇,欒春光,王德良*,姜欣

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊,830052) 2(中國食品發酵工業研究院,北京,100015)

老陳醋是一種以大曲為發酵劑經自然固態發酵的傳統發酵食品,是我國四大名醋之一。獨特的釀造工藝賦予了老陳醋醇、香、綿、柔的風味與口感[1-2]。老陳醋的香氣是評價其質量的重要依據[3],主要依靠不同種類的物質協同實現[4]。其中,香氣濃郁的酯類物質在老陳醋獨特香氣形成中發揮了重要的作用[5]。在老陳醋所包含的酯類物質中,乙酸乙酯所占比例最高,占香氣成分的60%以上[6]。因此,如何提高老陳醋中乙酸乙酯的含量對于進一步提升老陳醋的質量至關重要。在老陳醋的發酵過程中,乙酸乙酯主要來源于產酯酵母的代謝[7],這類酵母能夠在生長過程中利用葡萄糖為底物代謝產生乙醇、乙酸,并在自身酯化酶的催化作用下合成乙酸乙酯[8]。因此,篩選高產酯酵母也就成為了科研工作的重點研究之一。

我國科研工作者在篩選高產酯酵母上做了大量的工作。陳嘉等[9]從山西老陳醋發酵過程的酒醅中分離篩選產酯酵母,得到的3株產酯酵母中,1株畢赤酵母Y14與大曲混合發酵后,釀制的老陳醋乙酸乙酯含量較對照組提高了1.3倍。董凱鋒等[10]從水塔老陳醋大曲中分離得到1株產乙酸乙酯的異常威克漢姆酵母m12,其乙酸乙酯產量可以達到4.441 5 g/L。張杰等[11]從清香型小曲中篩選高產乙酸乙酯的酵母菌,得到1株異常畢赤酵母Y7,將其應用于清香型白酒的發酵中,其產乙酸乙酯含量為2.86 g/L,是傳統工藝釀造清香型白酒乙酸乙酯含量的1.5倍。目前對高產酯酵母篩選及功能特性的研究,雖然在一定程度上提高了乙酸乙酯的產量,但仍然無法滿足實際生產應用的需求。

本研究以通過來自不同食醋企業、白酒企業的醋醅、酒曲樣品為分離源,以篩選具有高產乙酸乙酯性能的酵母菌株為目的,研究其發酵相關功能特性。同時,對其產酯條件進行優化,旨在為產酯酵母的工業化生產提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

樣品來源：山西多家食醋企業提供的醋醅、大曲樣品；四川白酒企業提供的酒曲和酒醅樣品。

酵母浸出粉、蛋白胨、葡萄糖、孟加拉紅培養基,北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉,Biotopped；無水乙醇,天津市大茂化學試劑廠；山梨醇,浙江凱維嘉生物科技有限公司；酵母基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司；酵母菌PCR通用引物NL1和NL4、10×PCR buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、6×Loading Buffer,生工生物工程(上海)股份有限公司；安琪生香活性干酵母，湖北宜昌安琪酵母股份有限公司。

YPD液體培養基(g/L)：酵母浸出粉 10.0，蛋白胨 20.0，葡萄糖 20.0，115℃滅菌30 min；

YPD固體培養基(g/L)：酵母浸出粉 10.0，蛋白胨 20.0，葡萄糖 20.0，瓊脂粉 20.0，115℃滅菌30 min；

孟加拉紅培養基(g/L)：蛋白胨 5.0，KH2PO41.0，MgSO40.5，葡萄糖 10.0，氯霉素 0.1，孟加拉紅 0.033，瓊脂 20.0，121℃滅菌20 min；

產酯培養基(g/L)：酵母浸出粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖80.0，115 ℃滅菌30 min。

高粱汁培養基[12]：100 g高粱粉碎后加入800 mL蒸餾水煮沸1 h,適溫加入糖化酶與β-淀粉酶,于60 ℃水浴2～4 h,將過濾得到的濾液糖度調整為7°Brix。

1.1.2 儀器與設備

電子天平,梅特勒-托利多公司；微量移液槍,RAININ公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；LRH-250生化培養箱、渦旋振蕩器,美國Scientific Industries有限公司；高速微量離心機,湖南恒諾儀器設備有限公司；Biosystems Model溫度梯度PCR儀、Tanon1600凝膠成像儀,美國伯樂公司；BG-Power600電泳儀,北京百晶生物技術有限公司；雙人單面超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司；Auto System XL氣相色譜儀；CP-Wax 57CB毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm),美國Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離純化

稱取10 g樣品(大曲、醋醅或酒醅)置于裝有90 mL無菌蒸餾水的三角瓶中,28 ℃、150 r/min振蕩培養30 min。吸取菌懸液1 mL于9 mL無菌蒸餾水中,并依次進行梯度稀釋,配制成稀釋倍數為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液。分別取100 μL稀釋倍數為10-4、10-5和10-6的菌懸液均勻涂布于孟加拉紅培養基上,置于28 ℃恒溫培養2～3 d[13-14]。挑取具有典型酵母菌落特征的單菌落于YPD固體培養基上劃線分離純化。將具有酵母菌特性的菌株轉接于YPD斜面培養基中,于4 ℃進行保存備用[15]。

1.2.2 酵母菌株形態學鑒定

挑取保存于斜面培養基上的菌株,接種于YPD固體培養基上,28 ℃恒溫培養2 d活化,觀察菌落形態。同時,取少量菌體用于顯微鏡下鏡檢觀察[16]。

1.2.3 酵母菌株分子鑒定

取1 mL活化的酵母菌液,離心收集菌體,收集到的菌體經磷酸緩沖液清洗。然后,利用酵母基因組提取試劑盒提取酵母菌基因組DNA,提取的基因組DNA質量通過核酸蛋白測定儀ND-1000進行檢測。研究中以分離的不同酵母基因組DNA為模板,以NL1和NL4為引物[17],擴增26S rDNA目標基因對酵母菌株進行分子鑒定。用于擴增的PCR反應體系如下(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL；dNTP 2.0 μL,TaqDNA聚合酶0.3 μL,引物各1.0 μL；DNA模板1.0 μL；ddH2O 17.2 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min；35次循環；72 ℃修復延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果在NCBI數據庫中進行同源性比對分析。

1.2.4 酵母菌株產乙酸乙酯能力測定

挑取保存的酵母菌株于YPD液體培養基中,于28 ℃、150 r/min活化24 h。然后以10%的接種量接種于100 mL 7°Brix高粱汁培養基中,于28 ℃、150 r/min培養5 d[18]。將酵母菌液再分別接種于產酯培養基和添加少量乙醇、乙酸的高粱汁培養基中,以同樣的培養條件進行復篩。利用Auto System XL氣相色譜儀對發酵液中的乙酸乙酯含量進行測定。分析條件：CP-Wax 57CB毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)；起始溫度30 ℃,恒溫5 min,以5 ℃/min程序升溫至60 ℃,以6 ℃/min程序升溫至120 ℃,恒溫5 min,以8 ℃/min程序升溫至210 ℃,恒溫5 min；載氣(高純氮)：流速1 mL/min,分流比為10∶1；氫氣：流速為45 mL/min；空氣：流速為450 mL/min；檢測器溫度：260 ℃；進樣器溫度：240 ℃；進樣量：1 μL。

1.2.5 篩選菌株發酵相關特性研究

本研究從葡萄糖[19]、乙醇[20]、pH[21]、溫度[22]耐受性4個方面考察酵母菌株的發酵相關特性。將活化的酵母菌液以2%的接種量分別接種于不同條件的YPD液體培養基中,置于搖床中振蕩培養24 h。培養好的菌液于620 nm處測量其OD值。葡萄糖質量濃度梯度設置為100、200、300、400、500 g/L；乙醇體積分數梯度設置為6%、8%、10%、12%、14%；pH(用1 mol/L的鹽酸進行調節)梯度設置為1.5、2、2.5、3、4；溫度梯度設置為34、36、38、40和42 ℃。

1.2.6 酵母菌株產乙酸乙酯條件的研究

1.2.6.1 單因素發酵條件對乙酸乙酯產量的影響研究

為了探究葡萄糖濃度、溫度、pH、發酵時間以及乙醇含量在發酵過程中對乙酸乙酯產量的影響,研究中將篩選出的酵母菌株按照不同發酵條件接種于高粱汁培養基中,于搖床中振蕩培養,通過檢測乙酸乙酯的含量來確定各個單因素的最佳條件范圍[23-24]。培養基的pH值用1 mol/L的鹽酸進行調節,乙酸乙酯的檢測方法同1.2.4。

1.2.6.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上,結合實際發酵情況,選取溫度、pH值、乙醇含量(體積分數)3個因素,采用3因素3水平正交試驗[25-27]來進一步考察對乙酸乙酯產量的影響,正交條件如表1所示。

表1 酵母產乙酸乙酯3因素3水平正交條件表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for the production of ethyl acetate

1.2.7 數據處理

實驗數據采用Origin及SPSS Statistics 26軟件進行分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株的篩選與鑒定

結合菌落形態特征以及菌株鏡檢觀察的結果,從醋醅和酒醅中初步篩選得到了14株菌株,編號為Y1～Y14,典型菌株平板劃線圖及鏡檢圖見圖1。篩選的酵母菌株菌落形態多為圓形,表面光滑、呈乳白色,部分表面有絨毛、呈奶油色。顯微鏡鏡檢結果表明,在40倍放大的條件下觀察得到的酵母細胞形狀為圓形、卵圓形及橢圓形。

a-Y10平板圖;b-Y10平板圖;c-Y12平板圖;d-Y12平板圖圖1 菌株Y10、Y12平板劃線圖及鏡檢圖Fig.1 Strain Y10,Y12 plate and microscopic images

在形態學觀察的基礎上,對所篩選出的14株菌進一步進行分子水平鑒定。PCR擴增26S rDNA產物的1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。擴增得到的片段大小在600 bp左右,符合目的產物要求。

圖2 不同菌株26S rDNA PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of 26S rDNA of different strains

將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,所得序列在NCBI數據庫中進行BLAST同源性比對,比對結果如表2。鑒定結果表明,14株酵母菌株中有9株葡萄牙棒孢酵母,2株異常威克漢姆酵母和3株畢赤酵母。

表2 酵母菌株26S rDNA鑒定結果Table 2 Identification of yeast strains by 26S rDNA

2.2 酵母菌株產乙酸乙酯能力測定

利用高粱汁作為發酵培養基,對篩選得到的14株酵母菌株進行產乙酸乙酯能力的測定,檢測結果見表3。14株酵母菌株產乙酸乙酯的能力具有顯著差異。其中菌株Y10和Y12表現出較強的產乙酸乙酯能力,乙酸乙酯含量分別達到了6.68和4.73 g/L。其他菌株雖有產乙酸乙酯的能力,但均弱于Y10和Y12。因此,選用Y10和Y12這2株菌進行后續的發酵性能測試。

表3 不同菌株產乙酸乙酯情況Table 3 Ethyl acetate production by different strains

為探究菌株Y10和Y12產乙酸乙酯能力的穩定性,選用產酯培養基和不同成分高粱汁培養基進行復測(表4)。結果表明,菌株Y10和Y12在這2種培養基中也均表現出了較高的產乙酸乙酯能力,在添加少量乙醇、乙酸的高粱汁培養基中,2株菌的乙酸乙酯產量分別達到了9.01和7.05 g/L。在產酯培養基中,雖然乙酸乙酯產量較普通高粱汁培養基略有降低,但2株菌株依舊表現出了較高的產乙酸乙酯能力,并分別達到了4.56和3.51 g/L。且與對照菌株(市售某知名產酯酵母)相比較,這2株酵母產乙酸乙酯能力均具有相對優勢。

表4 不同培養基菌株產乙酸乙酯情況 單位：g/L

2.3 酵母菌株發酵相關特性研究

發酵過程中隨著糖化的進行,發酵液的糖度也在不斷升高,這使整個發酵環境的滲透壓被改變,從而對菌株的正常生長代謝和繁殖造成影響。為此,研究中首先考察不同葡萄糖濃度對菌株生長的影響。結果如圖3-a所示,當培養基中的葡萄糖含量不斷增加時,菌株的活性在不斷降低,當葡萄糖含量高于300 g/L時,酵母菌Y10、Y12以及對照菌株(市售某知名產酯酵母)的生長均受到了不同程度的抑制。其中,Y12表現出了最強的葡萄糖濃度耐受性,即在3株酵母中Y12具有最強的耐高滲能力。

乙醇是酵母菌發酵的產物,酵母菌可利用乙醇和乙酸在酶的作用下合成乙酸乙酯[28],發酵過程中不斷累積的乙醇濃度會對酵母菌的生長產生抑制作用。菌株的乙醇耐受性檢測結果如圖3-b所示。當乙醇體積分數低于10%時,被測酵母菌株均生長良好,同時,Y10和Y12對乙醇的耐受性整體優于對照菌株。

在發酵過程中,乳酸菌和醋酸菌等代謝會產生一定的乳酸和醋酸,導致發酵體系的pH值降低。因此具有良好的酸耐受性也是優良酵母菌株應具備的生物學性質之一。在圖3-c中可見,菌株Y10與Y12即使在pH為3～4時仍然生長良好,而且,Y12在pH為2.5時也表現出了較好的活性,其酸耐受性明顯優于參考菌株,說明菌株具有良好的環境適應性。

a-葡萄糖質量濃度；b-乙醇體積分數；c- pH；d-溫度圖3 不同條件下酵母菌株的生長情況Fig.3 Growth of yeasts strains at different conditions

除了以上3個條件外,溫度也是影響微生物生長代謝的重要因素之一,過高的溫度會影響微生物中酶的活性,從而減少代謝產物的生成。菌株的溫度耐受性結果如圖3-d所示,當溫度逐漸升高時,菌株的活性在不斷降低,菌株的生長受到了明顯的抑制。當溫度為36 ℃時,Y10和Y12尚能表現出較好的生存活力,表明兩菌株對高溫具有較好的耐受性。

2.4 單因素發酵條件對酵母菌株產乙酸乙酯能力的影響

在考察了菌株的基本發酵特性后,本研究從5個因素,包括葡萄糖濃度(6～12 °Brix)、溫度(24～30 ℃)、pH值(2～6)、乙醇體積分數(0～8%)和發酵時間(3～7 d),對篩選到的2株高產乙酸乙酯菌株的發酵條件做了進一步研究,用以了解單因素發酵條件對菌株產酯能力的影響。如圖4-a所示,當糖度為8°Brix時,菌株Y10和Y12的乙酸乙酯產量最高,分別達到2.47和1.62 g/L。研究中隨著糖度的升高,發酵環境的滲透壓也在逐漸增大,而較高的滲透壓破壞了酵母菌的細胞形態,從而影響了菌株的生長代謝,并最終導致菌株產乙酸乙酯能力降低[29]。在考察溫度對酵母菌產乙酸乙酯能力的影響時發現(圖4-b),菌株Y10與Y12的乙酸乙酯產量隨著溫度升高也呈現明顯的下降趨勢,這可能是因為,過高的溫度會引起菌株內相關酶活性的下降,并促進酵母體內合成較多的熱激蛋白,而乙酸乙酯的產量也相對減少[30]。在24 ℃時產量最高,2株菌的產酯能力分別達到9.59和7.47 g/L。因此,過高的糖度和溫度均可導致乙酸乙酯產量的下降。

a-糖度；b-溫度；c- pH；d-乙醇體積分數；e-發酵時間圖4 單因素發酵條件對酵母菌株乙酸乙酯產量的影響Fig.4 Effect of different fermentation conditions on yield of ethyl acetate

pH值和乙醇含量也在不同程度上影響著酵母菌株的乙酸乙酯產量。如圖4-c所示,當pH為4時,Y10和Y12的乙酸乙酯產量均達到最高值,分別為3.87和5.62 g/L。當pH值偏高或偏低時,對菌株的生長代謝均有明顯的抑制。同樣,在考察乙醇對菌株乙酸乙酯產量的影響時發現,乙醇體積分數為2%時Y10和Y12的乙酸乙酯產量分別達到了7.26和8.86 g/L(圖4-d)。陳醋發酵過程中,乙醇量在發酵前期是逐漸積累和增加的。高濃度的乙醇會對酵母細胞產生一定的毒害效應[31],同時也會促進酵母細胞體內海藻糖代謝增加來提升其乙醇耐受性[32],從而可能減弱了酵母菌自身利用乙醇產乙酸乙酯的能力。

發酵時間也是控制酵母菌株乙酸乙酯產量的重要因素之一。圖4-e表明,在發酵第4天,Y10和Y12兩株菌株的乙酸乙酯產量均達到最高,分別為1.264和1.21 g/L。發酵時間過短會導致發酵不足,乙酸乙酯的產量降低；而發酵時間過長菌株活力有所下降,加之乙酸乙酯的揮發量的增加,都會導致乙酸乙酯的產量的減少[33]。

2.5 正交試驗結果與分析

根據單因素試驗結果并結合實際發酵情況,進一步對菌株產乙酸乙酯能力影響較大的3個主要因素,包括溫度、pH、乙醇含量,進行正交試驗,以確定菌株Y10和Y12產乙酸乙酯的最優生產條件。結果如表5、表6所示,在A(溫度)、B(pH值)、C(乙醇濃度)3個影響因素中乙醇體積分數對乙酸乙酯的產量影響程度最大,3個因素的影響程度由高到低排序為C>A>B。根據試驗結果綜合分析,最優組合為A3B3C2,即在28 ℃、pH 6,乙醇體積分數為2%的條件下,菌株Y10和Y12的乙酸乙酯產量最高,分別能夠達到13.18和12.92 g/L,相比于優化前分別顯著提高了4.17和5.87 g/L。

表5 Y10產乙酸乙酯條件正交實驗結果Table 5 Orthogonal experiment results of Y10 for the production of ethyl acetate

3 結論

從工業化醋醅、酒醅樣品中分離得到了14株酵母菌株,分別進行產乙酸乙酯能力的測定。其中2株酵母菌株Y10和Y12表現出了較高的產乙酸乙酯能力,產量分別達到了6.68和4.73 g/L,經鑒定2株酵母均為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。結果表明,異常威克漢姆酵母Y10和Y12對發酵環境中的葡萄糖、酸、乙醇和溫度的變化均具有良好的耐受性。當發酵條件為：pH 6、乙醇體積分數2%、溫度28 ℃時,菌株Y10和Y12乙酸乙酯的產量最高,分別能夠達到13.18和12.92 g/L。相比優化前,2株酵母的產酯能力分別顯著提高了4.17和5.87 g/L。異常威克漢姆酵母Y10和Y12具有較高的產乙酸乙酯能力,具有較強的實際應用潛力。