紅曲磷蝦油軟膠囊的毒理安全性評價

張金秋， 江 賀， 張馨欣， 侯萬萍， 鄒 慧

(長春康彼達科技有限公司， 吉林 長春 130012)

隨著物質生活水平的提高和飲食結構的改變，人們攝入高熱量、高油脂食物的量增加，長期攝入高脂食物會干擾體內脂質代謝和抗氧化能力。當體內血脂過高后，致使體內形成大量自由基，導致細胞受損，加速細胞凋亡，人體衰老。脂肪在內臟中過多，會導致內臟功能減少；在血管內沉積，形成動脈粥樣硬化，易引發心腦血管等疾病。臨床研究發現，心腦血管疾病患者血液動力學檢查中的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-D)均有所升高，表明心腦血管疾病與血脂異常存在一定的關系。全球心腦血管的發病率逐年上升，已嚴重威脅到人的健康，據不全統計，每年因心腦血管等疾病導致的死亡人數占總死亡人數20%以上[1]。因此，有效控制血脂是預防動脈粥樣硬化的有效手段之一。

紅曲為藥食兩用傳統中藥材，主要含洛伐他汀(Monacolin K)、麥角固醇、γ-氨基丁酸、天然植物激素[2]等，具有調節脂代謝、降低血壓、降低血糖、預防和治療骨質疏松等廣泛的藥理作用[3-5]。南極磷蝦油作為海洋新興油脂，其含有多種不飽和脂肪酸等活性成分，其中具有代表性的EPA、DHA以磷脂形式存在，活性優于甘油三酯或乙酯，具有調節血脂作用[6-8]。玉米油中含豐富的不飽和脂肪酸、甾醇等成分，其中，亞油酸占油脂總量的50%以上，研究證明玉米油有顯著降低血清膽固醇的作用[9]。“紅曲磷蝦油軟膠囊”是由吉林省現代中藥工程研究中心有限公司研制，具有輔助降血脂功能的保健食品，以紅曲粉、南極磷蝦油為原料，玉米油等為輔料制成的軟膠囊。為評價紅曲磷蝦油軟膠囊的安全性，依據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)和《食品安全國家標準 急性經口毒性試驗急性毒性劑量分級標準》(GB 15193.3—2014)，采用急性毒性試驗、遺傳毒性試驗、28 d喂養試驗進行安全性考察。現將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 紅曲磷蝦油軟膠囊 其是以紅曲粉、南極磷蝦油為原料，玉米油為輔料，添加一定的蜂蠟作為助懸劑制成。該膠囊由吉林省現代中藥工程研究中心有限公司研制(批號：20180701)，規格0.5 g/粒，人體推薦用量為2 粒/次、2次/d。供試品為紅曲磷蝦油軟膠囊的內容物。

1.1.2 儀器與設備 電子天平(ME204E、AB135-S型)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；水浴鍋(HH-S114型)，金壇市華龍實驗儀器廠；血細胞分析儀(BC-280 vet型)、全自動生化分析儀(BS-420型)，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；尿液分析儀(Uritest-200 B)，桂林優利特電子集團有限公司；恒溫培養箱(SPX-100B-Z)，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；超凈工作臺(SJ-CJ-1FD)，蘇州蘇潔凈化設備有限公司。

1.1.3 試驗動物 SPF級SD大鼠、昆明小鼠，由西安交通大學醫學部動物實驗室提供。

1.1.4 藥物、試劑等 環磷酰胺、敵克松、秋水仙堿、疊氮化鈉(NaN3)、2-氨基芴(2-AF)、1，8-二羥基蒽醌、大鼠肝微粒體酶(S9)、小牛血清、Giemsa染液、伊紅染液、磷酸鹽緩沖溶液、尿液分析試紙、生化試劑盒(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)、TA1535、TA97a、TA98、TA100、TA102菌株，均購自于上海北思生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鼠急性毒性試驗 選取SD大鼠20只，雌雄各半，灌胃前禁食16 h，不限飲水，稱取供試品100 g，按18.43 mL/kg體重(相當于人體推薦用量的460倍)分2次(間隔6 h)經口灌胃，灌胃后連續14 d觀察記錄SD大鼠的中毒癥狀及死亡情況。同時選取20只SD大鼠，雌雄各半，做空白對照試驗。試驗0 d、7 d和14 d稱量大鼠體重，試驗結束后處死解剖[10]。

1.2.2 遺傳毒性試驗

1) 細菌回復突變試驗。選擇經基因型鑒定符合試驗要求的5株組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(TA1535、TA100、TA97a、TA98、TA102)進行試驗。稱取1.0 g供試品，加DMSO至20 mL，混合均勻，第1次5個受試物濃度分別為50 μg/皿、158 μg/皿、500 μg/皿、1 581 μg/皿和5 000 μg/皿，第2次分別為8 μg/皿、4 0 μg/皿、200 μg/皿、1 000 μg/皿和5 000 μg/皿，另設陽性對照組、自發回變組和去DMSO對照組，TA1535、TA100：NaN3(1.5 μg，-S9)；TA97a、TA98、TA102：敵克松(50.0 μg，-S9)，TA102：1，8-二羥基蒽醌(50.0 μg，+S9)；TA1535、TA97a、TA98、TA100：2-AF(10.0 μg，+S9)。各組受試物在0.103 MPa下濕熱滅菌20 min。各組均設3個平行皿，加入0.1 mL菌株增菌液，0.1 mL受試物(或對照物)和0.5 mL S9混合液(試驗組分別設加與不加S9組)，加入保溫的頂層培養基中混合均勻后用平鋪法置于底層培養基平板上，37℃恒溫培養48 h后，統計菌落數，試驗2次重復。

2) 小鼠骨髓細胞微核試驗。取小鼠50只，平均分成5組(每組雌雄各半)，分別設供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組，另設陰性對照組(大豆油)及陽性對照組(環磷酰胺40 mg/kg)。采用30 h灌胃法，第2次(與第1次間隔24 h)灌胃后6 h頸椎脫臼處死，取小鼠胸骨擠出骨髓，混合小牛血清，制片，干燥后固定、Giemsa染色，在顯微鏡下每只小鼠觀察1 000個嗜多染紅細胞(PCE)，計算微核發生率。

3) 小鼠精原細胞畸變試驗。取30只雄性小鼠，平均分成6組，分別設供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組，另設溶劑對照組(去離子水)和陽性對照組(環磷酰胺40 mg/kg)。連續灌胃5 d，高劑量組分別于末次給藥后24 h和48 h處死，其余劑量組在末次給藥后24 h處死，處死前5 h按5 mg/kg劑量給小鼠腹腔注射秋水仙素溶液(注射體積20 mL/kg BW)，將所有小鼠頸椎脫臼處死，取雙側附睪尾剪碎，加生理鹽水游離出精子，涂片，用1%伊紅染色制片，用光學顯微鏡觀察完整精子，每只小鼠觀察100個精子，記錄各類畸形精子數，計算畸變發生率。

1.2.3 28 d喂養試驗 選用68～93 g離乳SD大鼠100只，平均分成5組(每組雌雄各半)，分別設供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組，另設陰性對照組(大豆油)。停藥后15 d設高劑量組恢復期組和陰性組，每組10只，按4.0 mL/kg每天經口灌胃1次，連續28 d，觀察記錄大鼠的行為表現、中毒癥狀及死亡情況。灌胃結束后禁食隔夜，逐只稱重，用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血測定血液學指標和血液生化指標。

1.3 數據分析

對小鼠骨髓細胞微核試驗數據進行u檢驗；小鼠精原細胞畸變試驗數據進行二項分布統計；28 d喂養試驗數據進行方差齊性檢驗。

2 結果與分析

2.1 紅曲磷蝦油軟膠囊的急性毒性

從表1看出，用紅曲磷蝦油軟膠囊18.43 g/kg灌胃后大鼠生長良好，未見體重變化，未見有明顯中毒癥狀，14 d觀察期內無死亡。心、肝、脾、肺、腎、腸、胃等主要臟器均未發現明顯變化。表明，紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠LD50均大于18.43 g/kg，按劑量分級標準，紅曲磷蝦油軟膠囊屬于無毒級別。

表1 紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠的急性毒性

2.2 紅曲磷蝦油軟膠囊的遺傳毒性

2.2.1 細菌回復突變試驗 從表2、表3看出，回變菌落數紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組與未處理對照組(自發回變組)相近，且未發現劑量-反應關系，試驗結果為陰性，說明紅曲磷蝦油軟膠囊在+S9和―S9情況下，對5種類型菌株均無致突變性。

表2 第1次試驗的回變菌落數

表3 第2次試驗的回變菌落數

2.2.2 小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗 從表4看出，紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組的PCE/NCE與陰性對照組差異均不顯著(P>0.05)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對骨髓紅細胞增殖無明顯抑制；雌、雄小鼠陽性對照組的微核率與陰性對照組間差異極顯著，表明紅曲磷蝦油軟膠囊小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗結果均為陰性。

表4 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下小鼠骨髓多染紅細胞微核率(n=5)

2.2.3 小鼠精原細胞畸變試驗 染色體畸變類型主要以斷裂、斷片為主，一般正常小鼠精原細胞畸變率為0.8%～3.4%。從表5看出，紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組與陰性對照組間差異不顯著(P>0.05)，細胞畸變率陽性對照組與陰性對照組間差異極顯著(P<0.01)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對小鼠精原畸變試驗為陰性。

表5 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下小鼠的精子畸變情況

2.3 28 d喂養試驗

2.3.1 行為體征等 28 d喂養試驗期間紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠的外觀形態與對照組無明顯差異，生長良好，未發現異常行為和體征，未出現明顯中毒癥狀和死亡。從表6看出，紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠體重增重、總進食量、總食物利用率與對照組間差異不顯著(P>0.05)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠行為特征無影響。

表6 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的增重、食物總利用率(n=10)

2.3.2 血液學及血液生化指標 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量灌胃大鼠28 d，血液紅細胞計數、血紅蛋白水平、白細胞計數及其分類等指標，均滿足方差齊要求。從表7、表8看出，紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量組的各項指標與陰性對照間無顯著差異(P>0.05)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠血液學及血液生化各項指標無影響。

表7 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的生血液學指標(n=10)

表8 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的血液指標(n=10)

2.3.3 尿液與臟體指標 從表9、表10看出，紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠的尿液、禁食后體重、臟體比等指標與陰性對照組間無顯著差異(P>0.05)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠尿液、臟體指標無影響。

表9 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的尿液指標(n=10)

表10 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的臟體指標(n=10)

2.3.4 病理組織學 大鼠解剖肉眼未見異常。組織病理學檢查發現，紅曲磷蝦油軟膠囊高劑量組雌鼠有1例輕度肝小葉空泡變、1例腎輕度淤血、1例胃炎細胞浸潤，雄鼠有1例肝小葉炎細胞浸潤、1例脾色素沉積，其余組織均未見異常；陰性對照組雌鼠有1例輕度肝小葉空泡變、1例胃黏膜輕度水腫，雄鼠有1例腎皮質部腎小管空泡變、1例胃炎細胞浸潤，其余組織均未見異常。紅曲磷蝦油軟膠囊高劑量組(恢復期)雌鼠有1例肝小葉顆粒變性，雄鼠1睪丸間質水腫；陰性對照組(恢復期)雄鼠1例肝少量炎細胞浸潤、1例肝小葉空包變、1例腎皮質部腎小管腫脹，雌鼠1例胃少量炎細胞浸潤。以上病理學僅在個別大鼠中發生，各組病理變化無明顯差異，表明被檢臟器未見與紅曲磷蝦油軟膠囊有關的病理學改變。

3 結論

紅曲磷蝦油軟膠囊是由紅曲粉、南極磷蝦油以及玉米油配比，按照軟膠囊工藝制成的一款具有降血脂功能的保健食品。研究結果表明，紅曲磷蝦油軟膠囊以18.43 g/kg體重灌胃大鼠無中毒、死亡癥狀，表明此產品LD50大于18.43 g/kg，按照《食品安全國家標準 急性經口毒性試驗急性毒性劑量分級標準》(GB 15193.3—2014)，此膠囊屬于無毒級。細菌回復突變試驗、小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗、小鼠精原細胞畸變試驗結果均為陰性，表明紅曲磷蝦油軟膠囊無遺傳毒性。28 d喂養試驗的大鼠各項檢驗指標均未發現明顯改變，說明紅曲磷蝦油軟膠囊安全無毒。下一步將對該產品的降血脂功能進行驗證，完善該產品的質量控制標準，為產品的開發提供科學依據。