參歸補血湯提取工藝的優化及對IDA小鼠貧血的改善作用和JAK2/STAT3信號通路的影響

秦 瑞，吉世禹，劉俊寶，曹璐，冷維春*

（1.吉林大學中日聯誼醫院婦產科，長春 130033；2.吉林大學中日聯誼醫院藥學部，長春 130033）

參歸補血湯（參歸補血湯方）由當歸10 g，人參5 g，熟地黃10 g，白芍10 g等4味中藥組成，方中阿魏酸及多糖成分被認為是治療貧血類疾病的有效活性成分。因中藥復方中成分繁多、服用量大，因此以高效、減量、著重提取有效成分及部位為目的的提取工藝優化是當前研究的重中之重[1-2]。

本研究首先進行參歸補血湯提取工藝優化，基于小鼠缺鐵性貧血模型，考察其對缺鐵性貧血的有效性，并結合IL6誘導的HepG2細胞模型，探索參歸補血湯對缺鐵性貧血的改善作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性ICR（SPF級）小鼠購自長春億斯動物技術有限公司，60只，體質量（19±3）g，室內保持恒溫狀態（24±1）℃，普通飼料喂養，不限制進食和飲水，適應性飼養1周。

1.2 儀器與材料

1.2.1 儀器1）FA2004分析天平（常州市幸運電子設備公司）；2）高速離心機、RT-PCR儀（德國艾本德）；3）低速控溫臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；4）qRT-PCR、電泳儀、半干轉儀（美國BIO-RAD）；紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；高效液相色譜儀（日本島津）；酶標儀（奧地利TECAN）。

1.2.2 材料1）蘆丁標準品、葡萄糖分析標準品（源葉公司）；2）低鐵飼料（北京協同生物）；3）甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司），其余試劑均為分析純；4）中藥飲片當歸（批號：190606）、熟地（批號：10219027）、人參（批號：180501）、白芍（批號：07219029），均符合《中華人民共和國藥典》2020版一部藥用標準；5）復方硫酸亞鐵片（吉林西點藥業，批號189200）；6）Elisa試劑盒（長春晶美科技公司）；7）RNA提取試劑盒（北京全式金生物公司）；8）反轉錄試劑（TAKARA生物公司）；9）抗體（美國CST公司）。

1.3 提取方法的設計及驗證

1.3.1 水提取正交實驗設計根據參歸補血湯方主要活性成分的理化特點，采以水為提取媒介，進行提取工藝研究。按生產化要求，以加水倍數（15、20、25倍）、提取時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h）及提取次數（1、2、3次）為考察因素，以L9（34）進行正交實驗設計，確定最佳條件，因素水平見表1。

表1 參歸補血湯水提取因素水平

1.3.2 水提取工藝驗證取5批處方量藥材樣品，按最優工藝條件提取。測定各批提取液中阿魏酸及粗多糖的含量，計算RSD值。

1.3.3 有效成分含量測定1）阿魏酸含量測定。色譜柱：安捷倫C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸和乙睛，比例從9:1梯度洗脫至7:3，梯度洗脫15 min，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL，檢測波長230 nm；阿魏酸的線性回歸方程：Y= 6 503.1X-120.96，r2= 1，在 0.2～ 1.8 mg范圍內與吸光度呈良好的線性關系。2）粗多糖含量測定。取湯劑樣品50 μL置比色管中，補水至2 mL，加5%苯酚1 mL，渦旋混勻后加10 mL濃硫酸，沸水浴2 min，485 nm測定吸光度。總多糖的線性回歸方程：Y= 3.805 7X+ 0.0258，r2= 0.998 5，在 0～ 0.25 mg范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

1.4 小鼠缺鐵性貧血模型的建立

1.4.1 動物分組及給藥60只雌性小鼠分成空白、模型、陽性、低劑量、中劑量及高劑量6組，每組10只。空白組給予正常飼料；其余組給予低鐵飼料，飼養期間避免與鐵器接觸。造模40 d后持續給藥15 d，低劑量組 200 mg·kg-1·d-1、中劑量組 400 mg·kg-1·d-1、高劑量組800 mg·kg-1·d-1，陽性對照組給予復方硫酸亞鐵片 13 mg·kg-1·d-1。

1.4.2 Hepcidin及缺鐵性貧血藥效學相關指標檢測稱量各組小鼠體質量后，眼球取血，置4℃冰箱備用。按Elisa試劑盒說明書，測定血液中Hepcidin、Hb、FEP、Si、stfr和 TIBC 含量。

1.5 參歸補血湯抑制IL-6誘導HepG2細胞Hepcidin表達的研究

1.5.1 CCK8法檢測補血湯對HepG2細胞的抑制作用HepG2細胞鋪于96孔板中，密度每毫升5×103個。貼壁后空白組給予培養基100 μL；其余分別給予 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1、600 μg·mL-1及800 μg·mL-1當歸補血湯 100 μL，48 h 后加入 CCK8孵育50 min，于450 nm處檢測吸光度。

1.5.2 體外構建IL-6誘導HepG2細胞Hepcidin高表達的模型將HepG2細胞鋪于6孔板中，密度每毫升45×104個。貼壁后模型組給予50 ng·mL-1IL-6；給藥組造模后給予當歸補血湯200 μg·mL-1，48 h后提取細胞總蛋白及總RNA。1）Hepcidin mRNA的檢測：采用總RNA提取試劑盒提取HepG2細胞RNA，Takara反轉錄試劑盒轉錄，引物見表2，mRNA測定由PCR儀完成。2）JAK2/STAT3信號通路檢測：取各組由RIPA裂解的蛋白樣品加Loading Buffe后沸水浴5 min，進行SDS-PAGE。4 ℃過夜孵育一抗Betaactin（1:1 000）、JAK2（1:800）及 STAT3（1:200 0）后，孵育HRP標記的二抗（1:300 0）1 h，ECL法顯色。

表2 引物序列

2 結果與分析

2.1 水提取正交實驗結果

采用多指標綜合加權評分法對參歸補血湯中當歸阿魏酸及湯劑總多糖收率2項考察指標進行方差分析。設定滿分為100分，指標成分的比重分數為阿魏酸50、粗多糖50。在此基礎上進行總加權評分，利用綜合評分值（Pi）對實驗結果進行方差分析：以NXY表示第Y個指標成分下第X個指標成分的測定值，以各指標的最大值作為參照對同一指標各數據進行標準化處理；AXY表示第Y個指標成分下的第X個測定值的標準化數據。BXY=NXY/（NY）max，其中 X=1-9，Y=1，2。綜合評分Pi=∑比重分數×AXY。將總分結果帶入正交實驗結果中即得（見表3，表4）。

表3 參歸補血湯L9（3 4）水提取正交實驗設計表與結果分析

表4 參歸補血湯水提取工藝參數方差分析表

由綜合評分方差分析結果可知，各因素對提取效果影響均為顯著。確定最終提取工藝為：提取次數2次、提取1 h、加水量25倍。

2.2 水提取工藝重復性驗證結果

精密量取第5組A2B2C3方案的復方提取液，進行五次處方提取，測定吸光度。得5批次阿魏酸RSD = 1.35%，五批次多糖RSD = 2.83%，重復性均良好（見表5）。

表5 參歸補血湯水提取工藝重復性驗證結果

2.3 參歸補血湯對缺鐵性貧血小鼠相關指標及Hepcidin改善作用

與空白組相比，模型組小鼠的耳朵和爪子明顯蒼白，眼暗淡無色，毛發脫落，反應遲緩，體質量降低；Hepcidin、FEP顯著升高（P＜ 0.01），Hb、SI、stfr，TIBC和體質量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），證明貧血模型建立成功[9]。給藥15 d后，與模型組相比，參歸補血湯高劑量組小鼠的血常規指標和體質量明顯改善（P＜0.05或P＜0.01），且改善效果與陽性藥相當（見表6）。

表6 參歸補血湯對小鼠的體質量和血常規指標的影響（n=70）

2.4 參歸補血湯對IL-6誘導HepG2細胞相關信號通路影響

2.4.1 參歸補血湯對HepG2細胞的抑制作用CCK8結果可知 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和 150 μg·mL-1參歸補血湯對癌細胞無抑制效果，濃度200～800 μg·mL-1湯劑對HepG2細胞毒性抑制作用顯著增加（P＜0.001），后續實驗采用200 μg·mL-1進行機制驗證。

2.4.2 參歸補血湯對IL-6誘導HepG2細胞Hepcidin mRNA及相關信號通路蛋白影響結果表明參歸補血湯顯著降低經IL-6造模后的Hepcidin mRNA的表達（P＜0.001）（見圖2）；同時，WB結果表明相關JAK2/STAT3信號通路蛋白表達量顯著減低（P＜0.001）（見圖3）。

圖1 CCK8檢測參歸補血湯對HepG2細胞抑制率的影響（n = 8）

圖2 參歸補血湯對IL-6 誘導HepG2 細胞的Hepcidin mRNA表達的影響（n = 3）

圖3 參歸補血湯對IL-6誘導HepG2細胞的相關通路蛋白表達的影響（n=3）

3 討論

本實驗表明參歸補血湯水提取工藝穩定，提取效率佳；其對缺鐵性貧血小鼠貧血情況改善明顯，與模型組相比，小鼠血液中Hepcidin與FEP明顯下降，體質量、Hb、Si、STfR及TIBC明顯增加，其高劑量組效果與陽性藥組效果相似；其對IL6誘導的肝癌HepG2細胞共培養后Hepcidin mRNA表達顯著降低，相關p-JAK2及p-STAT3通路蛋白表達水平也顯著降低。結果表明參歸補血湯能通過抑制JAK2/STAT3通路下調Hepcidin的表達，從而達到改善缺鐵性貧血的作用。

Hepcidin是組織中鐵吸收和釋放的關鍵調節劑，能維持對紅細胞和其他組織的穩定鐵供應，同時避免高水平鐵對器官產生的有害作用[4]。實驗表明，通過抑制Hepcidin表達能夠升高貧血模型中血清鐵水平，進而糾正貧血癥狀[5]，與本研究結論一致，說明參歸補血湯具有改善缺鐵性貧血作用。另外，Hepcidin在腫瘤細胞中合成升高，增加胞內鐵保留，從而促進腫瘤存活[6-8]。提示我們，能夠通過降低Hepcidin表達進而促使鐵排出，達到抑制腫瘤的目的[9]。本研究中，參歸補血湯能降低肝癌HepG2細胞中Hepcidin mRNA表達，說明其調控鐵代謝不僅可改善缺鐵性貧血，亦具有抗腫瘤潛力。

IL-6能通過STAT3信號傳導刺激鐵調素轉錄。在未受刺激細胞中，STAT3在細胞質中保持無活性形式。IL-6/STAT3通路可將刺激信號從細胞表面傳導至細胞核，從而調控Hepcidin表達[10]。先前研究證明，JAK2/STAT3通路能夠通過調控Hepcidin，達到抑制胃癌細胞增殖和轉移的作用[11]。本研究發現參歸補血湯能夠通過抑制JAK2/STAT3通路表達，而實現對Hepcidin的調控作用。