α-生育酚通過抑制mTOR激活小鼠海馬神經元細胞自噬

武霽舟，王省

（南京中醫藥大學基礎醫學院/轉化系統生物學與神經科學研究中心/中醫腦病學重點實驗室，南京 210023）

自噬廣泛存在于真核生物，與各種生理活動和病理變化密切相關[1]。自噬作為促生存機制[2-3]，當細胞內環境穩態改變或機體受到刺激時，能夠清除胞內損傷的細胞器，保護細胞免于凋亡和壞死，在維持能量代謝、內環境穩態等方面起著重要作用[4]。細胞自噬還可以引起II型程序性細胞死亡，以清除受損細胞[5]，但過度激活可能導致多種疾病的發生[6]。

α-生育酚是維生素E的一種存在形式，具有很強的抗氧化能力[7-9]。越來越多的研究發現，抗氧化能力和自噬具有一定聯系[10-12]。因此，本研究在此基礎上，以HT22小鼠海馬神經元細胞為研究對象，觀察自噬現象，探索α-生育酚對細胞自噬的影響以及可能的分子機制。

1 材料與設備

1.1 細胞

HT22海馬細胞由南京中醫藥大學藥學院饋贈。

1.2 藥物和試劑

1）α-生育酚（上海元葉生物科技有限公司，批號J01020RA14，BR，純度50%）；2）抗體LC3-II，p-AMPK，p-mTOR（Cell Signaling Technology公司，批號分別為12753s，2535s，2971s）；3）p62（Sigma公司，貨號P0067）；4）RAPA裂解液（碧云天，P0013K）；5）BSA（Biofroxx公司，貨號4240GR100）；6）PBS（HyClone，貨號SH30256.01）；7）Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，Gibco公司，貨號C11995500BT）；8）MTT（BioFroxx公司，貨號3580GR001）；9）0.25%Trypsin-EDTA（Gibco，貨號25200-056）。

1.3 儀器

1）垂直電泳槽（Bio-RAD，貨號041BR11339）；2）超微量生物檢測儀（NanoDrop 2000，貨號G402）；3）自動化學發光圖像分析系統（Tanon-5200，貨號13T12NPFLI-1157）；4）高速離心機（Thermo Fisher，貨號75002455）。

2 方法

2.1 HT22細胞的培養及實驗分組

HT22細胞接種于10%FBS-DMEM完全培養基，于恒溫培養箱（37℃，5%CO2，95%空氣，飽和濕度）進行培養，1～2 d全量換液，待細胞融合度達70%～80%進行傳代。取對數生長期的HT22細胞，接種于6孔/96孔微量培養板，在完全培養基處理24 h后，隨機分為4組：1）Control組：1%FBS-DMEM處理24 h；2）C.C組：15 μm compound C處理24 h；3）α-生育酚組：25 μm α-生育酚處理 24 h；4）C.C＋ α-生育酚組：15 μm compound C 和 25 μm α-生育酚共同處理24 h。

2.2 免疫熒光法（AO）檢測自噬溶酶體

將HT22細胞接種于6孔板，按照設定的分組處理后，細胞在由PBS配制的1 ug·mL-1AO溶液中室溫孵育10 min，使用PBS洗滌細胞3次，在熒光顯微鏡下觀察樣品。

2.3 透射電鏡（TEM）檢測自噬體

細胞按設定的分組處理后，收集細胞置于2.5%戊二醛溶液固定、PBS洗滌、1%四氧化鋨溶液固定、PBS洗滌、梯度乙醇脫水、非環氧樹脂單體包埋。超薄切片60～80 nm后，用3%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察自噬體。

2.4 Western blot法檢測蛋白表達

將細胞接種于6孔板，按照設定的分組處理后，消化并收集細胞，經PBS洗滌后于冰上使用裂解液提取細胞總蛋白，測定并調整蛋白濃度，加熱變性后于-20℃冰箱保存。每組取等量蛋白進行電泳分離，將蛋白轉移至PDVF膜上后，于1%BSA封閉1 h，加入適當稀釋的一抗，4℃搖床過夜，TBST緩沖溶液洗膜3次，每次10 min，再加入適當稀釋的二抗，室溫搖床結合1 h，TBST緩沖溶液洗膜三次后置于顯影液中，顯色、曝光。

2.5 統計學方法

數據均以平均值±標準誤（mean± SEM）表示，使用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析，應用單向方差分析（ANOVA）和Bonferroni方法分析組差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞免疫熒光標記

與對照組比較，C.C＋α-生育酚組的橙色溶酶體數量明顯增加（見圖A）。

圖A α-生育酚對橙色溶酶體的影響[圖1-3（10X）；圖4-6（40X）]

3.2 透射電鏡觀察自噬體

按設定分組處理后，C.C預處理組自噬體數量顯著降低（P＜0.01），而α-生育酚增加了自噬體的數量（見圖B、C）。

圖B/C α-生育酚對自噬體數量的影響

3.3 Western Blot 檢測結果

α-生育酚通過抑制HT22細胞中mTOR激酶的表達而誘導自噬（見圖D）。與對照組相比，預處理α-生育酚能夠顯著降低由C.C誘導的LC3-Ⅱ的表達（a，P＜0.01），上調了P62的表達（b，P＜0.001）。α-生育酚能夠激活胞內p-AMPK的表達，但不能逆轉C.C對p-AMPK表達的抑制（c，相對于CTL組，P＜0.01；相對于C.C組，P＞0.05）。α-生育酚可以下調p-mTOR的表達（d，相對于C.C組，P＜0.05；相對于CTL組，P＜0.01）。C.C抑制ULK1的表達（e，P＜0.05，相對于CTL組）；α-生育酚能夠逆轉C.C對ULK1激酶的抑制作用，提高其表達水平（e，P＜0.05）。

圖D α-生育酚作用HT22細胞后相關蛋白表達的變化

4 討論

LC3的表達水平與自噬相關[13]，刺激自噬體的形成與抑制自噬體的降解均可導致LC3-Ⅱ表達水平升高。LC3-Ⅱ參與了自噬的全過程，能與新形成的膜相結合，直到自噬溶酶體的形成，其相對量與自噬體含量相關，其表達水平間接反應了自噬水平的高低[14]，這種LC3亞型也是目前檢測自噬體時最常用的分子標記之一。我們發現LC3-Ⅱ和LC3-I的總和在同一樣品中不一定相同，考慮到LC3抗體對LC3-Ⅱ的親和力可能高于LC3-Ⅰ，因此我們的研究只考慮了LC3-Ⅱ的水平。經α-生育酚干預后，HT22細胞自噬現象明顯增強，表現為AO染色下橙色溶酶體數量明顯增多，透射電鏡下觀察自噬體顯著增加，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達上調及p62水平降低。

mTOR是雷帕霉素的靶分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可多種蛋白相互作用，主要形成兩種不同的蛋白質復合物mTORC1和mTORC2[15]，其中mTORC1參與了ULK1復合物的調控[16]。mTORC1下游有三種不同的途徑，包括4EBP1，P70S6K1和S6激酶[17]，其中4EBP1和P70S6K1是mTOR激酶的真核翻譯起始因子的兩種調節劑。有絲分裂原和生長因子可激活P70S6K1并隨后磷酸化S6激酶，激活自噬。活化狀態的mTORC1復合體通過磷酸化ULK1、ATG13、ATG101和FIP200組成的ULK1復合體來抑制細胞自噬，降低ULK1激酶的活性；而誘導細胞自噬的信號通過抑制mTORC1激活ULK1復合體，促進自噬的啟動[18]。

除mTORC1以外，ULK1復合物的水平還受能量感受器AMPK的調控[19]。隨著對AMPK功能及作用機制的研究深入，越來越多的研究發現AMPK可以直接作用于ULK1調控自噬[20]。Compound Cs是AMPK特異性抑制劑[21]，本研究通過Compound C特異性抑制HT22細胞AMPK表達，進而降低細胞自噬水平作為自噬抑制模型，然后予以α-生育酚處理觀察其對自噬的影響以及明確α-生育酚自噬信號通路機制。實驗結果顯示C.C組能降低細胞自噬水平，加入α-生育酚干預后細胞自噬顯著提高，細胞內ULK1表達上調，p-mTOR水平下降。但α-生育酚并沒有提高AMPK的表達水平，提示AMPK不是α-生育酚誘導自噬的關鍵分子，其自噬誘導信號機制可能與抑制mTOR/ULK1信號通路有關。綜上，α-生育酚可誘導細胞自噬，AMPK不是α-生育酚誘導自噬的關鍵分子，其信號機制可能與抑制mTOR/ULK1信號通路有關。