響應面法優化竹葉青茶末中茶氨酸的提取工藝

蘭 林，汪晟羽，張晉森，袁 源，錢葉遷，謝 玲，李玉鋒*，李篤新

1.西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都 611730；2.四川大觀梁生態農業科技有限公司 四川 巴中 636000

竹葉青茶（Bamboo leaf tea）屬于眾多茶類中的一種，生長于“秀甲天下”的峨眉山，有著世界公認的產茶黃金地帶[1]。茶葉中含有多種人體所需的微量元素，近年來，一些國內、外的科學家均發現茶對健康的有益影響，如防癌、保護心血管、降血壓、調節免疫力等[2-6]。隨著茶產業的發展和人們需求的變化，茶副產物不斷增多。近年來，隨著茶葉深加工的不斷發展，剩余茶廢料得到有效利用，提取和分離純化得到多種生物活性物質。

茶氨酸（L-theanine）是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，占茶葉游離氨基酸總量的50%左右，是茶湯主要的呈味物質之一[7]，其保健功能和藥理作用不斷被發掘，并成為茶葉功能成分開發利用的熱點之一。有關研究表明，茶氨酸是一種安全、無毒、具備多種生物活性成分，具有延緩衰老、降血壓、鎮定、增強記憶力和減少焦慮或抑郁等功效[8-12]；目前茶氨酸已在食品的添加、功能性保健產品的開發、疾病的防御等多個鄰域有廣泛應用[13-14]。但據研究報道，與天然茶氨酸相比，合成的茶氨酸體內生物活性低[15]。因此，提取茶葉中的茶氨酸成為研究重點之一。目前，已有較多方法應用于茶氨酸的提取，如超臨界CO2萃取法提取[16]、利用超聲輔助提取[17]、利用復合酶法提取分離[18]、利用某些有機或無機試劑可與氨基酸形成不溶性反應物的特性分離法[19]及運用超濾膜法富集分離茶氨酸[20]等。但這些方法存在或多或少的問題，如微波輔助提取，提取率不能得到顯著提升；沉淀法操作復雜，對環境不友好，且容易造成茶氨酸損失；膜法分離技術的特點是工藝簡單、無相變，用于茶氨酸的初步提取，得到的茶氨酸純度不高等。綜合考慮采用離子交換層析法成本低廉，原料易得，樹脂可以循環反復使用，綠色且環保，操作不難和收率高[21]。本試驗以竹葉青茶末為研究對象，采用響應面法優化竹葉青茶末中茶氨酸提取工藝條件，為竹葉青茶末中茶氨酸的提取開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

竹葉青茶末，會園茶廠，四川樂山；磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、水合茚三酮，天津市致遠化學試劑有限公司；茶氨酸標品，源葉生物科技有限公司；NKA-II樹脂、大孔吸附樹脂AB-8，天津光復精細化工研究所；PA6樹脂、PA66樹脂，山東優索化工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高速粉碎機，永康皇代五金制品有限公司；BPG-9070A恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器；Molecular Devices SpectraMaxi3 X型多功能酶標儀及HHS-數據恒溫水浴鍋，美谷分子儀器有限公司；BT 423S電子天平，北京賽多斯科學儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶氨酸的提取

參照曹博等[22]的方法。取一定量的竹葉青茶末用粉碎機制成茶粉，稱取1 g過60目篩的茶粉放入燒杯中添加蒸餾水攪拌均勻，水浴鍋里浸提一定時間后提取茶湯備用。

超濾濃縮：選擇4種不同截留分子量的超濾離心管，截留分子量分別為100 KD、50 KD、10 KD、3 KD，對浸提后的茶湯進行超濾濃縮。

樹脂吸附：首先將 PA6、PA66、AB-8、NKA-II樹脂用超純水浸泡，通過浮選的樹脂用濃度為0.5 mol/L的HCl溶液浸泡24 h，沖洗至中性，用75%的乙醇溶液浸泡24 h，超純水沖洗至渾濁液出現，用質量分數為2% NaOH溶液浸潤24 h，用95%的乙醇沉淀，采取濕法上柱方式，沉淀后經冷凍干燥后即得茶氨酸。

1.3.2 標準曲線繪制

參照周國蘭[23]等人采用茚三酮檢測法，取1 mL待測樣液于試管中，加入500 μLpH值為8的磷酸緩沖液和500 μL質量分數為2%的茚三酮溶液，在100℃水浴下沸騰15 min，待自然冷卻，加水定容至25 mL。放置10 min，取1 mL于24孔板中，570 nm測定OD值。配制濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的茶氨酸標準液，每組試驗平行三次。并以濃度為X軸、OD值為Y軸繪制標準曲線。

1.3.3 單因素試驗

分別選用不同孔徑的目篩過濾茶末（20目、40目、60目、80目、100目）、提取溫度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、提取時間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min）和液料比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30）進行單因素試驗，考察各因素對茶氨酸提取率的影響，確定最佳提取工藝。

1.3.4 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，采用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken設計試驗組合，分別選取液料比（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）對茶氨酸得率影響顯著的三因素進行三因素三水平的響應面法優化試驗（表1）。

表1 響應面水平和因素設計Table 1 Response surface level and factor design

1.3.5 數據分析

采用Origin 9.0軟件進行試驗圖表繪制，采用Design-Expert 8.0.6統計軟件進行響應面優化分析。

2 結果與分析

2.1 茚三酮標準曲線

結果見圖1。根據分析得到線性回歸方程式：Y= 0.1216X+0.0068，R2= 0.9995，可見，線性關系良好。

圖1 茚三酮標準曲線Figure 1 Standard curve of ninhydrin standard

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 液料比對茶氨酸提取率的影響

由圖2可知，在提取溫度80℃、提取時間60 mim、蒸餾水中提取條件下，隨著液料比增加到1∶15時茶氨酸含量達到最大，隨后便降低。因此，考慮綠色環保等因素，試驗選用液料比為 1∶15。

圖2 液料比對茶氨酸提取率的影響Figure 2 Effect of liquid material ratio on the extraction rate of theanine

2.2.2 提取溫度對茶氨酸提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，茶氨酸提取率呈現先增加后降低的趨勢，80℃時達到最高。因此，試驗選擇80℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對茶氨酸提取率的影響Figure 3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of theanine

2.2.3 提取時間對茶氨酸提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的增加，茶氨酸提取率逐漸上升，60 min時達到最高，后隨著提取時間的延長迅速降低。因此，試驗選取提取時間為60 min最佳。

圖4 提取時間對茶氨酸提取率的影響Figure 4 Effect of extraction time on the extraction rate of theanine

2.3 響應面優化試驗

試驗結果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對上表2試驗中所得數據建立二次回歸方程分析，得到回歸模型：Y=2.84+0.051A+0.11B+0.14C-0.02AB+0.022AC+0.03BC-0.3A2-0.11B2-0.21C2。響應面回歸模型的方差分析結果見表3。實驗所選模型P= 0.0002 < 0.05，模型具有極顯著性；由F= 2.53，失擬項P值= 0.1959 > 0.05，失擬項不顯著；R2Adj= 0.9264，擬合程度良好。此模型測試誤差小，說明模型試驗值和預測值有很好的相關性。

表2 響應面試驗設計方案及試驗結果Table 2 Response surface test design scheme and test results

表3 響應面回歸模型結果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model results

為了更好研究各變量之間的關系，基于上述回歸方程結果，利用響應面軟件進行可視化分析，繪制響應曲面圖和等高線圖如圖5所示。由圖5可看出：隨著液料比和提取時間的增加，茶氨酸提取率逐漸增高，且交互作用堅強，響應面曲面較陡；液料比和提取溫度等高線呈現較圓且等高線較短交互作用不明顯；提取時間和提取溫度對茶氨酸提取率交互效應次之。試驗提取參數對茶氨酸提取的影響程度從大到小依次為提取溫度>提取時間>液料比。

圖5 各因素交互作用對茶氨酸提取得率的響應面及等高線圖Figure 5 Response surface and contour plots of the interaction of various factors on the theanine extraction rate

2.4 驗證試驗結果

基于踐行節約資源降低成本的原則，為驗證模型的準確性，采用單因素試驗和響應面進行驗證，根據試驗結果確定竹葉青茶末中茶氨酸提取的最佳工藝為液料比15∶1、提取溫度80℃和提取時間60 min，進行3次重復試驗驗證，得到茶氨酸提取率為44.12%，與試驗預測值較為接近，表明試驗模型可靠。

3 結論

在單因素試驗基礎上結合Box-Behnken中心組合設計原理模型的分析方法對竹葉青茶末中茶氨酸提取工藝進行優化，建立液料比、提取溫度和提取時間與茶氨酸的回歸模型。結果表明，模型具有較高顯著性合理可靠，最后得出最佳提取工藝參數為液料比1∶15、提取溫度80℃和提取時間60 min。在此工藝參數的驗證試驗下茶氨酸得率為44.12%，且純度為91.23%（根據QB/T 4263—2011方法檢測），與響應面的預測結果有較好的一致性，說明運用響應面法優化竹葉青茶末中茶氨酸的提取工藝可行，可為茶葉中茶氨酸的提取與開發利用提供一定的參考。