四種茶兒茶素在蒸餾酒和水中的變化研究

蘭 余，呂楊俊，張海華，朱躍進，劉 均，曹曉念，馮華芳，劉青青，張 平，張士康*

1. 瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；2. 中華全國供銷合作總社 杭州茶葉研究院，浙江 杭州 310016

茶多酚占茶葉干重的15% ～ 30%，而兒茶素占茶多酚總量的60% ～ 80%。茶鮮葉中兒茶素主要以表型結構存在，主要有EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）、EGC（表沒食子兒茶素）、ECG（表兒茶素沒食子酸酯）和EC（表兒茶素）四種[1-3]。兒茶素溶于水、乙醇、冰醋酸、丙酮溶劑，其分子結構中的B 環酚羥基活躍，使得兒茶素在溶劑中易發生異構化、水解、氧化/聚合、縮合等轉化反應[4-5]。兒茶素在溶劑體系中的變化情況，關系其在食品、醫藥等多領域的應用性能，因此國內外學者對兒茶素在食品飲料、焙烤加工、熱水提制、茶湯沖泡乃至血液等方面的變化開展了多樣研究[6-10]。這些研究都是以水為溶劑，不含乙醇。但隨著兒茶素功能應用范圍的拓寬和廣泛關注，兒茶素在含乙醇體系中的變化研究必不可缺。本文針對兒茶素在乙醇體系（含硬飲料）中變化研究的盲點，開展兒茶素在蒸餾酒和水兩種體系中的變化對比性研究，以期彌補研究空白，亦期為兒茶素在食品硬飲料中應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料

茶多酚和兒茶素單體（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院食品技術研究所），經水法粗提、專用樹脂純化、中壓色譜分離制得。其中，茶多酚，含總多酚81.98%、EGCG 33.45%、EC 2.80%、ECG 7.73%、EG 3.55%、GA 0.18%、CAF 0.88%；EGCG，純度77.89%；EGC，純度77.75%；ECG，純度84.32%；EC，純度86.29%。蒸餾酒（瀘州老窖股份有限公司，酒精度45.5%，生產批號2015-04-14），四川瀘州老窖生產基地經固態純糧發酵制得。冰乙酸、乙腈、甲醇等化學試劑（國藥集團化學試劑有限公司），均為色譜純。

1.1.2 主要儀器

Waters 1525系列高效液相色譜儀及Waters 2998紫外檢測器、自動進樣器成套設備（上海Waters科技有限公司），C18色譜柱4.6*250 mm，5 μm（美國菲羅門Phenomenex公司），分析天平（1/10000）（梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

準確稱取綠茶茶多酚與4種兒茶素單體各1.00 g，分別于蒸餾酒和水體系中溶解并定容至1000 mL，四等份分裝于250 mLPET瓶中密封、25℃避光貯藏，于第0 d、1 d、2 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d、105 d、120 d取樣測定兒茶素含量。

1.2.2 兒茶素總量及組分測定

按GB/T 8313—2018方法進行測定。每個樣品重復制備3 次，樣品中兒茶素含量重復測定 3 次。

1.2.3 數據處理與統計

采用EXCEL計算平均值。兒茶素測定數據的圖表制作、線性擬合采用EXCEL軟件完成。

2 結果與分析

2.1 兒茶素在蒸餾酒和水體系中貯藏變化

圖1 可見，茶多酚（TP）和四種兒茶素單體（EGCG、EGC、ECG、EC）在25℃避光條件下于蒸餾酒和水兩種體系中變化存在差異。圖1（Ⅰa）顯示，茶多酚在蒸餾酒體系中隨著貯藏時間延長，四種主要兒茶素總量逐漸降低，其中簡單兒茶素（EC、EGC）降幅最大，EGC在30 d時降至檢出限（0.01 μg/mL）下，EC在60 d時已降了2/3至15 μg/mL。酯型兒茶素（EGCG、ECG）亦呈下降趨勢，降幅較簡單兒茶素小，至120 d時約降低50%。圖1（Ⅰb）顯示，茶多酚在水體系中隨著貯藏時間的延長，酯型兒茶素（EGCG、ECG）均呈下降趨勢，其中EGCG尤為明顯；簡單兒茶素（EGC、EC）呈增大結果，尤其是EGC；此外，在水體系中6 ～ 90 d期間還測定出GA（沒食子酸）。

圖1 四種兒茶素在蒸餾酒（a）和水（b）中濃度變化（Ⅰ:茶多酚；Ⅱ:EGCG；Ⅲ:EGC；Ⅳ:ECG；Ⅴ:EC）Figure 1 Concentration changes of four catechins in distilled wine (a) and water (b)system

圖1（Ⅱa）可看出，EGCG單體在蒸餾酒中變化趨勢與茶多酚中EGCG具有一致性，隨時間出現降低，同時體系中可測得ECG隨時間呈增長趨勢。馬夢君等[11]研究發現，25℃下貯藏的茶多酚水溶液中兒茶素總量及EGCG、ECG含量隨著貯藏時間的延長而不斷降低。圖1（Ⅱb）可看出，EGCG單體在水中隨時間延長而降低，同時EGC和GA出現增加趨勢，體系貯藏中兒茶素單體測定值總和80%分布在720 μg/mL以上，與初始值770 μg/mL相差約50 μg/mL。

圖1（Ⅲa）結果顯示，EGC在蒸餾酒中降低趨勢明顯，在0 ～ 30 d時可測到樣品中初始含有的微量ECG、EGCG至30 d后均低于檢出限，同時EGC降低趨勢未變。圖3（Ⅲb）結果顯示，EGC在水體系中也呈降低趨勢，降幅較蒸餾酒體系中小，同時伴隨微量EGCG和ECG可檢出。

圖1（Ⅳa）可看出，ECG單體在蒸餾酒中降幅明顯，且未曾檢測出其他三種單體。圖1（Ⅳb）可看出，ECG單體在水體系中表現出和EGCG單體相似變化，隨著時間延長，ECG降低的同時EC和GA增多且單體體系中兒茶素總量保持較高濃度。

圖1（Ⅴa）顯示，EC單體在蒸餾酒中降幅明顯，幾乎未檢測到其他三種單體。圖1（Ⅴb）顯示，EC單體在水中總體下降，120 d時達最低濃度720 μg/mL，未檢出其他三種單體和GA。

2.2 兒茶素在蒸餾酒和水中的穩定性比較

對蒸餾酒體系而言，對比圖1（Ⅰa ～Ⅴa），四種兒茶素無論是混合態還是單體在蒸餾酒體系中均呈一致降低的趨勢，從結果推測降低過程中幾乎不能有兒茶素單體之間的轉化。經數學擬合處理，四種單體在蒸餾酒體系中變化都較符合一元線性關系（R2= 0.8591 ～ 0.9661），按四種單體濃度降低50%的時間長短排序為EGCG＜EGC＜EC＜ECG（表1），此時間順序表征了四種單體在蒸餾酒中的穩定性。同步擬合茶多酚（混合態）中EGCG的變化，同樣呈線性關系，濃度降低50%，時間卻延長至45 d。

表1 兒茶素在蒸餾酒體系中變化線性擬合結果Table 1 Linear fitting results of catechins in distilled liquor system

對水體系而言，對比圖1（Ⅰb ～ Ⅴb），四種兒茶素無論單體還是混合態都呈趨勢一致的變化，四種兒茶素單體總量略有降低，但基本維持在A 0 ～ 70%A 0范圍（A0，0 d測定值），總體上簡單兒茶素比酯型兒茶素穩定。從測定值推測，兩種酯型兒茶素（EGCG、ECG）均發生了較大程度的水解反應，即EGCG→EGC+GA，ECG→EC+GA；兩種簡單兒茶素（EGC、EC）發生了30%左右的小幅降低，幾乎不能推測出單體間轉化反應的發生。

對比兩種體系，從四種單體的分子結構（圖2）這一根本闡釋，四種物質的分子結構主要差異在于R1和R2基團，結合蒸餾酒體系中四種單體的Date[C50]（d）結果，加之乙醇分子中的羥基可形成氫鍵，且乙醇4.3＜蒸餾酒的溶解度參數（極性）7.52＜水10.20，推測四種兒茶素分子結構中R2基團比R1基團更活躍，即R2基團比R1基團對兒茶素在蒸餾酒中不穩定的貢獻度更高、作用更強。

圖2 （-）-表型（順式）兒茶素類分子結構圖Figure 2 Molecular structure of (-)-phenotypic (CIS) catechins

3 討論

本試驗探討了25℃避光密封貯藏下四種兒茶素在蒸餾酒和水兩種體系中含量的變化，結果表明茶多酚和四種兒茶素單體在蒸餾酒和水兩種體系中穩定性表現差異較大，在水中的穩定性比蒸餾酒體系中高。從兒茶素類變化的可能性反應原理推測，在蒸餾酒體系中尤為顯著的發生了非水解反應，極可能是發生了氧化、聚合等其他類型的反應；而在水體系中酯型兒茶素和簡單兒茶素的下降趨勢一致，但下降原因各異，其中酯型兒茶素主要發生了水解反應含量降低，而簡單兒茶素則發生了水解以外的其他反應。從蒸餾酒和水兩種體系本身而言，蒸餾酒中除含有乙醇外，還含有重要呈香類物質如酯類、其他醇類等多羥基化合物，從理論上推測這些化合物的羥基對兒茶素類變化極可能產生影響，這也可能是兒茶素類在蒸餾酒和水體系中變化不一致的重要因素。試驗結果為兒茶素類在食品體系中的穩定性研究提供了新的數據。