長(zhǎng)鏈非編碼RNA同源盒基因 A11反義RNA在急性淋巴細(xì)胞白血病患兒骨髓中的表達(dá)及意義

白東琴，白玉，田富香

延安市人民醫(yī)院兒內(nèi)科，陜西 延安 716000

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是血液系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，起源于造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞，其特征為未成熟的白細(xì)胞大量聚集在血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟及其他器官。人

ABL

基因位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂，9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上

C-ABL

原癌基因易位至22號(hào)染色體長(zhǎng)臂的斷裂點(diǎn)集中區(qū)（BCR），形成

BCR/ABL

融合基因。兒童ALL約占兒童急性白血病的80%，一般經(jīng)過(guò)規(guī)范化治療，患兒的長(zhǎng)期生存率為70%～80%，但ALL的復(fù)發(fā)率高，且一旦復(fù)發(fā)疾病進(jìn)展快，病死率高。目前普遍認(rèn)為，遺傳因素、環(huán)境影響、基因改變可能是導(dǎo)致ALL發(fā)生的危險(xiǎn)因素，但尚不清楚ALL的確切病因及發(fā)病機(jī)制。因此，尋找潛在的治療靶點(diǎn)成為當(dāng)前ALL的研究熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)RNA，其長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的異常表達(dá)不僅可導(dǎo)致多種實(shí)體瘤，還也與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA同源盒基因A11反義RNA（lncRNA homeobox A11 antisense RNA，HOXA11-AS）是一種位于染色體7p15.2上的新型lncRNA。研究顯示，lncRNA HOXA11-AS與多種惡性腫瘤有關(guān)，但尚無(wú)與急性淋巴細(xì)胞白血病的研究報(bào)道。本研究探討HOXA11-AS在ALL患兒骨髓中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2021年3月延安市人民醫(yī)院收治的初治ALL患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、免疫分型檢查、分子生物學(xué)及遺傳學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：初診前接受過(guò)化療或ALL相關(guān)治療。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入108例初治ALL患兒，其中男66例，女42例；年齡3～12歲，平均（6.27±1.95）歲；病理類型：B淋巴細(xì)胞型（BALL）67例，T淋巴細(xì)胞型（T-ALL）41例。同期選取本院收治的57例非腫瘤性疾病（血友病、免疫性血小板減少癥等）患兒，其中男34例，女23例；年齡4～12歲，平均（7.01±1.62）歲。三組患兒性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。取108例初治ALL患兒的骨髓標(biāo)本和57例非腫瘤性疾病患兒的骨髓標(biāo)本。

1.2 治療方法

所有初治ALL患兒均依據(jù)《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議（第四次修訂）》中的治療方案進(jìn)行治療（以化療為主），均接受2個(gè)療程的治療，治療結(jié)束后評(píng)價(jià)患兒的治療效果。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 主要試劑和儀器人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，HOXA11-AS引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，Prime Script逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒和SYBR Premix Ex-Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，7300型實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3.2 實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)骨髓標(biāo)本HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量 取108例初治ALL和57例非腫瘤性疾病患兒治療前的骨髓液2 ml，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝處理，加入等量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）充分混勻，再加入等量人淋巴細(xì)胞分離液，3000 r/min離心10 min，吸取中間層的單個(gè)核細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入PBS洗滌1次后，使用Trizol試劑提取總RNA，應(yīng)用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。根據(jù)Prime ScriptRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），反應(yīng)過(guò)程：42℃15 min，85℃10 s，然后參照SYBR Premix Ex-Taq Ⅱ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體積為20μl，其中包含3μl稀釋和預(yù)擴(kuò)增的cDNA、上下游引物各0.25 μl，10 μl SYBR預(yù)混料ExTaq和1μl熒光探針、5.5μl無(wú)RNA酶水，反應(yīng)條件：95℃預(yù)反應(yīng)10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40次循環(huán)。所有樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并計(jì)算每個(gè)樣本的平均值，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，使用生物系統(tǒng)軟件RQ Manager v1.2.1處理數(shù)據(jù)，采用2方法計(jì)算HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量。HOXA11-AS上游引物：5'-GCCACAUGCACCCGCCUGCUGAA-3'，下游引物 ：5'-CAUCAGACACAGUCCACUAUGCG-3'；

GAPDH

上 游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)量的比較

108例初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量為（4.79±1.08），明顯高于非腫瘤性疾病患兒的（1.13±0.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=24.759，

P

=0.000），其中B-ALL型初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量為（4.26±0.93），明顯低于T-ALL型患兒的（5.66±1.33），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=6.429，

P

=0.000）。108例初治ALL患兒經(jīng)2個(gè)周期的化療后完全緩解46例，未完全緩解62例，完全緩解患兒HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量為（1.46±0.35），明顯低于未完全緩解患兒的（3.28±0.94），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=3.262，

P

=0.000），且完全緩解和未完全緩解患兒骨髓HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于初治ALL患兒的（4.79±1.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=7.203，

P

=0.000）。

2.2 不同臨床特征初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)量的比較

不同性別、年齡、染色體核型、原始細(xì)胞比例、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、血小板計(jì)數(shù)、

WT1

基因表達(dá)情況初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)量的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；

BCR/ABL

融合基因陽(yáng)性表達(dá)初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量，明顯高于

BCR/ABL

融合基因陰性表達(dá)患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)量的比較（ n=108）

3 討論

ALL是由于造血干細(xì)胞惡性增殖、凋亡受阻導(dǎo)致的原始與幼稚淋巴細(xì)胞分化受阻，抑制正常的造血功能，侵犯髓外器官的血液系統(tǒng)常見(jiàn)惡性疾病之一。雖然經(jīng)過(guò)規(guī)范化治療，ALL的緩解率較高，但復(fù)發(fā)率也較高，且疾病一旦復(fù)發(fā)，進(jìn)展快、病死率極高。因此，探討ALL的發(fā)病機(jī)制和耐藥機(jī)制對(duì)改善ALL的治療效果具有重要意義。

lncRNA曾被認(rèn)為是“暗物質(zhì)”，但隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明這些“暗物質(zhì)”具有極為重要的生物學(xué)功能。研究顯示，lncRNA的異常表達(dá)可導(dǎo)致多種實(shí)體瘤，如肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等，且lncRNA的異常表達(dá)也與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究報(bào)道，ALL患者骨髓細(xì)胞中存在lncRNA的異常表達(dá)，甚至可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒1-反義鏈1（zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1，ZEB1-AS1）在B-ALL型患者骨髓中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，可與白細(xì)胞介素-11結(jié)合，并促進(jìn)其表達(dá)，且高表達(dá)ZEB1-AS1的B-ALL型患者的預(yù)后更差。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA RP11-137H2.4在ALL患兒中明顯高表達(dá)，主要通過(guò)促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)與細(xì)胞周期通路導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素耐藥的發(fā)生。

HOXA11-AS是一種位于染色體7p15.2上的新型lncRNA。研究顯示，HOXA11-AS與多種惡性腫瘤有關(guān)，但目前與ALL相關(guān)的研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量明顯高于非腫瘤性疾病患兒，提示HOXA11-AS過(guò)表達(dá)可能與ALL的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，B-ALL型初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量明顯低于T-ALL型患兒，提示HOXA11-AS在不同類型的ALL中的表達(dá)存在差異。進(jìn)一步結(jié)合初治ALL患兒的臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、染色體核型、原始細(xì)胞比例、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、血小板計(jì)數(shù)、

WT1

基因表達(dá)情況的初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)明顯差異（

P

＞0.05），但

BCR/ABL

融合基因陽(yáng)性表達(dá)初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量，明顯高于

BCR/ABL

融合基因陰性表達(dá)患兒（

P

＜0.01）。本研究結(jié)果還顯示，完全緩解患兒HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量，明顯低于未完全緩解組和初治ALL患兒，提示HOXA11-AS的高表達(dá)可能與ALL患兒的不良預(yù)后有關(guān)，但仍有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量再次證實(shí)。綜上所述，HOXA11-AS在初治ALL患兒骨髓中高表達(dá)，且在T-ALL型患兒中高表達(dá)，化療后完全緩解和

BCR/ABL

融合基因陰性表達(dá)的ALL患兒骨髓中HOXA11-AS的相對(duì)表達(dá)量更低，提示HOXA11-AS可能參與ALL的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并與ALL患兒的預(yù)后有一定關(guān)系。