牡蠣葛根固體飲料對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血脂癥小鼠的血脂調(diào)節(jié)及肝臟保護(hù)作用研究*

林桂宇，黃 斌，成芳梅，王翠榮，韋錦斌，黃仁彬，趙勁民

（廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021）

高血脂癥（hyperlipemia，HLP）是指體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂、升高的狀態(tài)，進(jìn)而造成血脂成分含量增高[1]，在臨床上主要表現(xiàn)為總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的異常升高[2]。HLP 是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的直接因素，而動(dòng)脈粥樣硬化是誘發(fā)心腦血管疾病的直接因素。臨床常用于調(diào)節(jié)血脂的藥物有他汀類和貝特類藥物。然而，這兩種藥物存在諸多的不良反應(yīng)，且可能導(dǎo)致老年患者肝功能異常[3]。

中醫(yī)認(rèn)為HLP 是血濁病、“膏”病等，病機(jī)為肝失疏泄、脾失健運(yùn)、痰瘀內(nèi)阻，治療方法主要為理肝調(diào)脾、化痰濕濁、活血化瘀[4]。牡蠣葛根固體飲料（OKPD）是由牡蠣、葛根、山楂、苦瓜4 味中藥組成。牡蠣富含豐富的蛋白質(zhì)和鋅，具有保肝、降血糖、抗腫瘤等藥用價(jià)值[5]。葛根具有解肌退熱、升陽(yáng)舉陷的功效，常用于陰虛消渴、脾虛泄瀉等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素具有降血脂的作用[7]。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道OKPD 治療HLP 的相關(guān)研究。本研究用Triton WR-1339 誘導(dǎo)小鼠HLP，探討OKPD 對(duì)HLP 小鼠的療效及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重（20±2）g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 桂2014-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2014-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于通風(fēng)條件良好，溫度在18～25 ℃，相對(duì)濕度在40%～70%，12 h 光照晝夜循環(huán)的環(huán)境。

1.2 藥物的制備 OKPD（批號(hào)：20190616）是由葛根、山楂、苦瓜、牡蠣4 味藥物按一定比例組成。其中葛根、山楂、苦瓜各2 kg，牡蠣粉1.2 kg。葛根、山楂、苦瓜3味藥，先干燥后粉碎為80目，加水煎煮（2次，第1 次10 倍量，第2 次8 倍量，2 h/次），濃縮，得到濃縮膏。向濃縮膏中加入牡蠣粉1.2 kg（90 ℃烘烤30 min，超細(xì)粉），淀粉0.35 kg，糊精50 g，混勻，制成顆粒，備用。1 g OKPD相當(dāng)于12 g生藥材。成人每日用量為20～30 g（顆粒劑）/60 kg體重。

1.3 主要試劑 非諾貝特購(gòu)自法國(guó)利博福尼制藥公司。Triton WR-1339 購(gòu)自Sigma 公司。LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、TC、TG、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、一氧化氮（NO）、總NO 合成酶（T-NOS）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究；通用SP試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物技術(shù)有限公司；兔抗核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、白細(xì)胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；通用二抗購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 動(dòng)物分組、給藥及模型建立 將60 只小鼠隨機(jī)分為6 組，即正常對(duì)照組、模型組、非諾貝特陽(yáng)性對(duì)照組及OKPD高、中、低劑量組，每組10只。非諾貝特陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予0.03 g/kg 非諾貝特，OKPD 高、中、低劑量組分別灌胃給予10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg的OKPD。給藥體積為20 mL/kg，連續(xù)給藥14 d，1次/d。正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水。末次給藥后1 h，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠腹腔注射600 mg/kg Triton WR-1339 構(gòu)建HLP 模型[8-9]。

1.5 動(dòng)物處置及標(biāo)本制備 造模24 h 后，麻醉小鼠，眼眶取血，靜置、離心、取血清，超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。處死后取小鼠肝臟，一部分浸泡于4%甲醛溶液中，用于病理檢查和免疫組化。另一部分存放于液氮中，用于檢測(cè)肝功能指標(biāo)。

1.6 血清生化指標(biāo)的檢測(cè) 收集小鼠血清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、T-NOS水平。

1.7 肝組織病理學(xué)檢查 取4%甲醛固定24 h后的肝臟組織，行蘇木精—伊紅（HE）染色，于低倍鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.8 免疫組化法檢測(cè)肝臟組織中TNF-α、NF-κB、IL-6 蛋白表達(dá) 取出肝組織，常規(guī)石蠟包埋、切片。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，滴加一抗TNF-α（1∶800）、NF-κB（1∶1 000）、IL-6（1∶600），4 ℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶10 000）孵育2 h，PBS 沖洗5 次后，染色、封片、閱片。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃棕色顆粒為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。用Image Pro plus 6.0軟件分析NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白表達(dá)量，以平均光密度值表示蛋白的相對(duì)定量（平均光密度值=累積光密度值/陽(yáng)性面積）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OKPD 對(duì)HLP 小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平的影響 模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平較正常對(duì)照組顯著升高，HDL-C水平較正常對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，OKPD 高、中劑量組TC、TG 水平顯著下降，OKPD各劑量組HDL-C 水平顯著升高，LDL-C 顯著下降（P＜0.05），OKPD 低劑量組TC、TG 水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；OKPD 高劑量組TC 水平顯著低于OKPD 低劑量組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 OKPD對(duì)HLP小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響mmol/L，，n=10

表1 OKPD對(duì)HLP小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響mmol/L，，n=10

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與OKPD低劑量組比較，&P＜0.05。

2.2 OKPD 對(duì)HLP 小鼠血清中AST、ALT、T-NOS水平的影響 模型組小鼠血清中AST、ALT、T-NOS水平較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，非諾貝特陽(yáng)性對(duì)照組及OKPD高、中劑量組小鼠血清AST、ALT水平顯著下降，OKPD各劑量組T-NOS水平顯著降低（P＜0.05），OKPD高劑量組AST 水平顯著低于OKPD 低劑量組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 OKPD對(duì)HLP小鼠血清中ALT、AST、T-NOS水平的影響，n=10

表2 OKPD對(duì)HLP小鼠血清中ALT、AST、T-NOS水平的影響，n=10

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與OKPD低劑量組比較，&P＜0.05。

2.3 OKPD對(duì)HLP小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下可見(jiàn)，正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，核大而圓，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，清晰，肝索呈放射狀分布，肝間質(zhì)無(wú)明顯炎癥浸潤(rùn)，整體無(wú)氣球樣變、點(diǎn)狀壞死及灶性壞死，未見(jiàn)病理改變。模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹，排列混亂，變形，部分胞質(zhì)溶解，呈空泡狀；肝小葉模糊不清，肝細(xì)胞核濃縮變小，呈點(diǎn)狀壞死；肝細(xì)胞之間邊際不清，中央靜脈區(qū)和匯管區(qū)分布有大量炎性細(xì)胞，同時(shí)可見(jiàn)明顯脂滴。OKPD高、中劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，呈放射狀排列，少見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹、壞死及炎癥浸潤(rùn)，OKPD低劑量組肝細(xì)胞雖較模型組有所改善，但依然可見(jiàn)肝細(xì)胞排序混亂、變形，腫脹，部分肝細(xì)胞呈空泡樣，見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠肝臟組織HE染色圖（×200）

2.4 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α 及IL-6 蛋白表達(dá)比較 NF-κB、TNF-α、IL-6 陽(yáng)性表達(dá)分別定位于肝細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜、細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙中。與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；非諾貝特陽(yáng)性對(duì)照組及OKPD各劑量組肝組織NF-κB、TNF-α及IL-6 蛋白表達(dá)較模型組明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2、圖3。OKPD高、中、低劑量組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖2 肝組織NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白表達(dá)的免疫組化染色圖（×400）

圖3 6組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)比較

3 討論

Triton WR-1339，又稱四酚丁醛，是一種非離子型表面活性劑，現(xiàn)常作為實(shí)驗(yàn)性HLP 的誘導(dǎo)劑，廣泛應(yīng)用于降脂藥物的篩選。Triton WR-1339通過(guò)抑制脂蛋白脂肪酶的活性，可在短時(shí)間內(nèi)引起機(jī)體血清TC及TG異常，具有操作簡(jiǎn)便，迅速的優(yōu)點(diǎn)[10]。文獻(xiàn)報(bào)道Triton WR-1339 誘導(dǎo)HLP 模型受劑量及造模時(shí)間的影響[11]。綜合文獻(xiàn)的研究報(bào)道及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究的造模方案為一次性腹腔注射600 mg/kg Triton WR-1339，造模時(shí)間為24 h。

HLP 時(shí)機(jī)體內(nèi)脂類物質(zhì)發(fā)生顯著改變，TC、TG、LDL-C 水平異常升高，HDL-C 水平異常降低，以上指標(biāo)常作為評(píng)價(jià)HLP 的“金標(biāo)準(zhǔn)”。在諸多危險(xiǎn)因素中，LDL-C 的升高被認(rèn)為是最危險(xiǎn)的因素。LDL-C 積蓄于血管內(nèi)皮上，在氧化因子的作用下，進(jìn)一步氧化形成氧化型LDL（ox-LDL）。ox-LDL可觸發(fā)血管內(nèi)皮上的系列炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，加重機(jī)體的炎癥狀態(tài)[12]。因此，LDL-C 升高被認(rèn)為是不利因素。而HDL-C 則與之相反，在HLP 時(shí)，其呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，被認(rèn)為是有利因素。肝臟、小腸等機(jī)體多數(shù)器官參與TG 的合成與代謝，其中以肝臟合成能力最強(qiáng)。因此，通過(guò)檢測(cè)肝臟功能了解HLP的進(jìn)程是必要的。Triton WR-1339 作為化學(xué)物質(zhì)，可增加肝細(xì)胞膜的通透性，使得肝細(xì)胞內(nèi)重要的酶如ALT、AST外漏。同時(shí)，異常升高的脂質(zhì)可反向加重肝臟的脂代謝負(fù)擔(dān)，進(jìn)一步加劇肝臟細(xì)胞的損傷，阻礙脂代謝。二者相互作用，使得HLP和肝損傷惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Triton WR-1339 誘導(dǎo)的小鼠血清ALT及AST水平較正常對(duì)照組升高，表明在HLP 發(fā)生的同時(shí)伴隨著肝臟的損害。而OKPD 給藥組小鼠血清ALT、AST 水平較模型組顯著降低，說(shuō)明OKPD 具有護(hù)肝的功效。以上結(jié)果提示，在降脂藥的研發(fā)過(guò)程及在臨床工作中，應(yīng)該關(guān)注HLP引發(fā)或合并肝臟損害的情況，以便更好地指導(dǎo)臨床工作。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體抵御外界有害物質(zhì)侵入機(jī)體的常見(jiàn)病理過(guò)程，控制炎癥對(duì)于維持機(jī)體的正常代謝功能及抑制疾病的進(jìn)展具有重要意義。研究表明，TNF-α 的激活與肝臟病變存在密切聯(lián)系。NFκB 是炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程的重要介質(zhì)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程的重要因子。促炎因子的激活導(dǎo)致炎癥因子如NF-κB及其下游因子的釋放，引發(fā)機(jī)體炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。TNF-α是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的中樞炎癥促進(jìn)細(xì)胞因子，是控制炎癥過(guò)程的關(guān)鍵。IL-6主要由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種復(fù)雜生理功能，在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)或感染時(shí)，TNF-α 等多種細(xì)胞因子可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IL-6[14]。當(dāng)上游刺激因子如TNF-α被激活時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化反應(yīng)，激活NF-κB。活化的NF-κB 因子核定位序列被暴露，轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)特定位點(diǎn)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄程序，產(chǎn)生或激活下游的其他因子。下游其他因子又可以反向激活NF-κB因子，形成反饋調(diào)節(jié)模式，從而使炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)大，加劇疾病的進(jìn)展。Triton WR-1339誘導(dǎo)劑作為外源性物質(zhì)注射到小鼠體內(nèi)，激活TNF-α、IL-6等促炎因子及NF-κB炎癥因子。因此，有效抑制TNF-α、IL-6、NF-κB 的活化可以有效抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而緩解疾病的進(jìn)展。本研究中，模型組小鼠肝索周圍可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)，肝細(xì)胞變性、壞死，OKPD 高、中、低劑量組少見(jiàn)炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，而OKPD 給藥組較模型組明顯降低。提示OKPD 能有效抑制HLP 小鼠肝組織炎癥反應(yīng)。

綜上，OKPD通過(guò)抑制TNF-α、NF-κB、IL-6等炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)血脂，對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血脂癥小鼠發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。