甘蔗葉多糖對大鼠心肌梗死后心肌纖維化的影響*

劉 丹，林 錕，侯小濤，何 濤Δ

（1.湖南省人民醫院星沙院區，長沙 410000；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021；3.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001）

心肌梗死是一種臨床常見危重癥，具有高致殘率和致死率。心肌梗死后心肌纖維化是心肌組織對缺血刺激產生的一種自我修復的過程[1]。在心肌梗死早期可形成瘢痕，防止心臟破裂，但后期隨著細胞外基質過度蓄積，無收縮功能的瘢痕組織替代受損的心肌，心室順應性下降[2]，最終發展為心力衰竭。因此，如何有效減輕心肌間質纖維化是防治心肌梗死后心衰的重要策略。有研究顯示，心肌纖維化的發生、發展受多種基因及蛋白的調控，其中細胞因子TGF-β1、NF-κB 及ERK1/2 與心肌纖維化密切相關[3-4]，其在刺激細胞外基質的合成、促進心肌成纖維細胞分泌膠原蛋白等效應中發揮重要作用[5]。本課題組前期研究發現，甘蔗葉多糖能促進梗死區周圍心肌組織的血管內皮生長因子（VEGF）的表達[6]，對缺血心肌有一定的保護作用。此外，甘蔗葉多糖藥效研究顯示，其具有抗炎、抗氧化、抗自由基等作用[7]，能減輕炎癥反應，而炎癥反應在心肌纖維化的發生發展中起著十分重要的作用。為明確甘蔗葉多糖能否減輕大鼠心肌梗死后心肌纖維化，本研究通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支建立心肌梗死模型，檢測心肌梗死后心肌纖維化的程度及上述相關因子的表達，探討甘蔗葉多糖對大鼠心肌梗死后心肌纖維化可能的調控機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性8周齡SD大鼠26只，體重(230±20)g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK(桂）2014-0002。

1.2 材料和試劑 甘蔗葉多糖（廣西中醫藥大學侯小濤老師課題組提供）；Ⅰ型膠原抗體（博奧森公司，bs-0578R）；Ⅲ型膠原抗體（博奧森公司，bs-0549R）；通用SP試劑盒（北京中杉橋生物技術有限公司）；Trizol Reagent（美國賽默飛世爾科技公司）；逆轉錄試劑盒（大連寶生物，RR036A；熒光定量試劑盒（大連寶生物，RR820A）；引物合成（上海生工）；磷酸酶抑制（Roche 公司）；一抗、二抗稀釋液（武漢博士德公司，AR1017）；兔一抗p44/42 MAPK(ERK1/2)（美國CST 公司）；兔一抗Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)（美國CST 公司）；兔一抗GAPDH（美國CST 公司）；二抗羊抗兔IgG（英國Abcam，ab97051）。

1.3 主要儀器 動物呼吸機（上海奧爾特生物科技有限公司，ALC-V9）；心電圖機（日本福田公司，FCP-2155）；PCR 儀（美國Bio-Rad，CFX connect）；ECL 化學發光成像儀（美國ProteinSimple，FliorChem HD2）；超聲波細胞破碎儀（美國SONICS）；蛋白印跡電泳、轉膜系統（美國Bio-Rad）；正置熒光顯微鏡（OLYMPUS，BX53）。

1.4 大鼠心梗模型的制備、分組及給藥 26只健康SD 大鼠參照文獻結扎冠狀動脈左前降支制備大鼠心肌梗死模型[8]。結扎前后分別記錄心電圖，造模成功的標準：結扎后肢導ST段較結扎前抬高。將造模成功后大鼠隨機分為模型組（MI 組）、處理組（SLP組），另設假手術組（Sham組），Sham組只穿線未予結扎。造模后第1 天開始，各組分別進行灌胃處理，SLP組灌入甘蔗葉多糖溶液（4 g/L），按1 mL/100 g 大鼠體重給藥，MI 組及Sham 組灌入等量的0.9%生理鹽水，連續4周。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測NF-κB、TGF-β1 mRNA 表達 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區組織中，取50 mg 左右梗死周邊區心肌組織，剪碎、超聲勻漿后采用Trizol 法提取RNA，經PrimeScriptTMRT Master 試劑盒反轉錄成cDNA，Ta-KaRa SYBR ExScript RT-PCR Kit 進行qPCR 反應，GAPDH 為相對定量參照物，2-△△CT計算基因表達水平。GAPDH 上游序列：5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游：5'-G ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；TGF-β1 上游序列：5'-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3'，下游：5'-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3'；NF-κB 上游序列：5'-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3'，下游：5'-TCCGGAACACAATGG CCAC-3'。

1.6 Western blotting檢測p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表達 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區組織中，取50 mg左右梗死周邊區心肌組織，剪碎后經超聲勻漿破碎后提取蛋白。經電泳、轉膜、孵育一抗(GAPDH、ERK、p-ERK均為1∶1 000)、二抗（1∶5 000）、ECL 化學發光底物顯色后，使用FliorChem HD2 成像系統（ProteinSimple）觀察，DRAFT-alphaview 計算圖像條帶灰度值，計算P-ERK1/2/ERK1/2 蛋白相對表達。

1.7 大鼠心肌結締組織染色 取梗死周邊區心肌組織，經4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋制成切片，光學顯微鏡下觀察，Masson染色檢測梗死邊緣區心肌間質纖維化的程度，正常的心肌纖維被染成紅色，纖維化的膠原纖維被染成藍色，細胞核則染成黑藍色，纖維化程度用膠原容積分數(CVF)（CVF=膠原面積/所測視野面積）表示。免疫組化觀察梗死周邊區Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達情況，陽性為梗死邊緣區心肌間質著色棕色或棕黃色的片狀區域，陽性反應強度用MIOD（MIOD=IOD/AOI）表示，陽性反應強度與Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達量呈正相關關系。每張切片在10×40倍視野下隨機選取5個視野，采用Image-pro plus 6.0 軟件分別計算每張切片的CVF、MIOD。

1.8 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 與SNK 檢驗，方差不齊時，多組間均數比較則采用Welch 分析；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區NF-κB、TGF-β1mRNA 和p-ERK1/2/ ERK1/2 的表達 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區TGF-β1、NF-κB mRNA 和p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白均表達。與Sham組相比，MI 組TGF-β1、NF-κB mRNA 表達明顯增加，而SLP組中TGF-β1、NF-κB mRNA表達較MI組顯著降低（均P＜0.05）。與Sham 組相比，MI 組、SLP 組中p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表達顯著增加，而SLP 組中p-ERK1/2/ERK1/2 較MI 組表達明顯降低（均P＜0.05），見表1，圖1。

表1 各組大鼠心肌梗死邊緣區組織TGF-β1、NF-κB mRNA和p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表達

圖1 各組大鼠心肌梗死周邊區組織p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表達水平的比較

2.2 各組MASSON染色結果及心肌梗死周邊區心肌間質的膠原容積分數比較 光學顯微鏡下，Sham組心肌無纖維化現象，均為正常的心肌纖維，未見纖維化的膠原纖維；MI組和SLP組均有心肌纖維化現象，SLP 組纖維化較MI 組明顯減輕（圖2）。與Sham 組比較，SLP 組和MI 組CVF 顯著升高（P＜0.05），與MI 組比較，SLP 組CVF 明顯降低（P＜0.05），見表2。

圖2 各組MASSON染色結果比較（×400）

表2 各組大鼠心肌梗死周邊區心肌間質的膠原容積分數比較

2.3 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區心肌間質Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達 光學顯微鏡下觀察顯示，Sham組未見Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達；而SLP組和MI 組梗死周邊區心肌間質內均可見被染成棕色片狀的Ⅰ型膠原蛋白及棕黃色斑片狀散在分布Ⅲ型膠原蛋白；SLP組Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達較MI組明顯減少（圖3、圖4）。SLP組和MI組梗死周邊區心肌間質均有Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達，與Sham組比較，Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的MIOD 明顯升高（P＜0.05），而與MI 組比較，SLP 組Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的MIOD顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠心肌梗死4 周后心肌間質Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的結果

圖3 免疫組化測各組大鼠心肌梗死4周后梗死邊緣區Ⅰ型膠原蛋白（×400）

圖4 免疫組化測各組大鼠心肌梗死4周后梗死周邊區Ⅲ型膠原蛋白（×400）

3 討論

心肌梗死后心肌纖維化是心衰、惡性心律失常、心源性猝死等心血管疾病發生發展的重要病理、生理基礎，如何有效的減輕心肌梗死后心肌纖維化是防治上述并發癥發生、發展的重要靶點。

心肌纖維化涉及一系列復雜細胞因子及多種基因和蛋白的激活、表達與調控。有研究顯示，TGF-β1 是引起纖維化最重要的細胞因子，TGF-β1可促進心肌成纖維細胞增殖分化為肌成纖維細胞，并可誘導Smad2/3的激活[9]，導致細胞外基質合成與降解間動態平衡被打破[10]，加速心肌纖維化形成。有研究發現，下調TGF-β1 表達可從多途徑減輕心肌纖維化[11]。此外，炎癥因子的水平與心肌纖維化的程度密切相關，有研究顯示，抑制NF-κB 信號通路激活減少梗死心肌組織中促炎性細胞因子（TNFα，IL-1β 和IL-6）的生成[12]，減輕炎性細胞因子對心成纖維細胞的刺激作用，減少心肌間質膠原蛋白的合成，從而減輕小鼠心肌梗死后的炎癥反應和心肌纖維化。

甘蔗是屬于禾本科甘蔗屬的植物，甘蔗葉中含有黃酮類、有機酸、多酚、維生素、甘蔗多糖等多種化學成分[7]，其中多糖在抗氧化、抗炎、加強免疫、降血糖等方面發揮著重要作用[7]。有研究報道，當歸多糖通過抑制MAPK/NF-κB通路，減少心肌梗死后高濃度炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-6 的生成[13]，從而減輕炎癥反應，延緩心肌梗死后心肌纖維化進程。本實驗結果顯示，甘蔗葉多糖能抑制TGF-β1、NF-κB mRNA 的表達（均P＜0.05），提示甘蔗葉多糖減少心梗后心肌纖維化可能與抑制促纖維化基因TGF-β1、NF-κB mRNA的表達有關。

此外，ERK1/2信號通路在調節成纖維細胞增殖及間質纖維化中有重要的生物學功能[4]。有研究表明，磷酸化ERK1/2可以上調miR-21的表達，增強心肌成纖維細胞的增殖、分化[14]，從而導致心肌細胞外基質蓄積，引起心肌間質纖維化，而下調p-ERK1/2/ERK1/2 的表達，可減輕心肌纖維化[15]。本研究發現，甘蔗葉多糖能下調p-ERK1/2/ERK1/2的表達（均P＜0.05），表明甘蔗葉多糖減少心肌梗死后心肌纖維化，亦可能與下調p-ERK1/2/ERK1/2的表達相關。

既往研究表明，Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白是心肌間質的主要成分，其中Ⅰ型膠原與心肌舒張收縮的僵硬度有關，Ⅲ型膠原與室壁彈力有關，Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的合成增加，降解減少及合成與降解失衡，是心肌纖維化主要發病機制[16]。本研究Masson 染色結果發現，甘蔗葉多糖能明顯減少心肌間質的CVF，而免疫組化結果同樣表明甘蔗葉多糖能明顯減少心肌間質Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達（均P＜0.05），表明甘蔗葉多糖能減少心肌梗死后心肌細胞外基質過度蓄積，減輕心肌梗死后心肌纖維化。

總之，甘蔗葉多糖能減輕大鼠心肌梗死后梗死邊緣區心肌間質纖維化，其機制可能與抑制促纖維化基因TGF-β1、NFκ-B mRNA的表達，下調p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表達有關。