小白菊內酯調控自噬抑制食管癌細胞增殖和轉移的作用研究*

呂娉婷，付 瑤，宋 慧

（遼寧省遼陽市中心醫院 1.藥學部；2.藥庫；3.藥局，遼陽 111000）

食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發病率和病死率在全球惡性腫瘤中居第四位[1]，在我國惡性腫瘤發病率中排第二，病死率排第三[2]。食管癌的危險因素包括遺傳背景、吸煙、飲酒、胃食管反流病、飲食和肥胖等[3]。由于食管癌早期無癥狀，多數患者在初診時已處于晚期，目前對于食管癌晚期患者的治療手段有限，患者的預后仍然較差[4]。中藥在食管癌的治療中取得了較大的療效，其作為臨床化療藥物的補充治療顯著改善了食管癌患者的預后[5]。小白菊內酯（parthenolide，PTL）是傳統藥材芳香植物小白菊（tanacetum parthenium）的主要活性成分，具有較強的抗炎、抑菌、解痙作用。研究發現，PTL能明顯抑制肺癌、結直腸癌及食管癌細胞的增殖、遷移和凋亡[6-8]，表明PTL 具有抗腫瘤活性。自噬是不同于細胞凋亡的另一種程序性死亡現象，對于維持內環境的穩態起著重要作用。在腫瘤的發生發展過程中，自噬對于腫瘤的生長起到了負性調控作用[9]。本研究旨在探討PTL調控自噬抑制食管癌細胞增殖和轉移的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞和主要試劑 PTL、自噬抑制劑3-MA 和自噬誘導劑Rapamycin 均購自美國Selleckchem 公司；食管癌細胞系Eca109 購自中國上海科學院細胞庫；DMEM 細胞培養基和胎牛血清（FBS）購自上海弘順生物科技有限公司；MTS細胞增殖試劑盒購自中國北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室購自美國Coring公司；高效蛋白裂解液購自上海貝博生物科技公司；BCA蛋白濃度檢測試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購自北京索萊寶試劑公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；P62、Beclin1、LC3 Ⅱ和GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司；ECL 化學發光試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養 食管癌細胞Eca109 快速復蘇后，用含10%FBS的DMEM完全培養基，置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養。每48 h更換細胞培養基，當細胞匯合度達到70%時，胰酶消化、傳代，取生長狀態良好的細胞進行實驗。

1.3 MTS法檢測細胞增殖 用DMEM完全培養基調整細胞濃度為1.5×104個/mL，以每孔100μL細胞懸液接種至96 孔板，分為不同濃度（2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 和40 μmol/L）PTL組和對照組（NC 組、0 μmol/L PTL），每組6 個平行復孔。處理48 h 后，更換100 μL DMEM 完全培養基，每孔加入20 μL 的MTS 試劑，混勻，繼續培養2 h。采用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度（OD）值。細胞增殖抑制率=（1－OD 值PTL 組/OD 值NC 組）×100%。

采用DMEM完全培養基調整細胞濃度為1×105個/mL，以2 mL/孔細胞懸液接種于6 孔板，分為4組：NC 組、PTL 組、PTL+Rapamycin 組、PTL+3-MA組。PTL組加入10 μmol/L PTL，PTL+Rapamycin組加入10 μmol/L PTL 和10 μmol/L Rapamycin，PTL+3-MA 組加入10 μmol/L PTL 和5 μmol/L 3-MA，NC組加入等量二甲基亞砜（DMSO）。同以上方法檢測各組細胞增殖抑制率。實驗重復3次。

1.4 Transwell檢測細胞遷移 用DMEM無血清培養基調整細胞濃度為1×106個/mL，以100 μL/孔細胞懸液接種于Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上，Transwell 小室的下室加入500μL DMEM 完全培養基，置于5% CO2、37 ℃全濕度培養箱中培養12 h。穿膜細胞經PBS 洗滌3 次，置于甲醇溶液中固定10 min，吉姆薩染色30 min。顯微鏡下觀察，計算穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.5 裸鼠皮下成瘤實驗檢測細胞體內生長能力 用PBS 調整細胞濃度為5×107個/mL，以100μL/只細胞懸液注射于裸鼠左側腋下。給予動物充足的水和食物，并在適宜的環境中飼養。將成瘤裸鼠隨機分為NC組和PTL組，每組6只。注射食管癌細胞1周后，PTL組灌胃給予2 mg/kg PTL，NC組灌胃給予等量DMSO，每隔一天灌胃1 次，連續21 d。每周觀察成瘤情況，測量裸鼠成瘤的體積。給藥結束時，將瘤體剝離出，對瘤體進行稱重。

1.6 Western blotting法檢測自噬相關蛋白表達

加入高效蛋白裂解液裂解細胞，4 ℃、14 000 r/min 離心30 min，取上清，BCA 法檢測蛋白濃度，煮沸使蛋白變性；每組取50μg 蛋白，行SDS-PAGE 電泳（80 V、2 h），濕轉法（350 mA、1.5 h）將蛋白轉移至PVDF膜；8%脫脂牛奶室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；加入一抗P62、Beclin1、LC3Ⅱ（均1∶500）和GAPDH（1∶1 000），置于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜3次；加入二抗（1∶8 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次。采用ECL 化學發光法凝膠成像系統Dolphin-View顯示蛋白條帶。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達量。實驗重復3次。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PTL抑制食管癌細胞Eca109增殖 0 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 和40 μmol/L 組PTL 細胞增殖抑制率分別為（0.52±0.23）%、（14.16±3.04）%、（25.47±5.59）%、（42.25±2.36）%、（63.32±7.89）%和（75.18±5.34）%，PTL呈濃度依賴性地抑制食管癌細胞Eca109 的增殖（均P＜0.05），PTL 作用Eca109 細胞IC50值為（9.53±1.28）μmol/L。

2.2 PTL調控自噬對食管癌細胞增殖能力的影響 與NC 組比較，PTL 組、PTL+Rapamycin 組和PTL+3-MA 組細胞增殖抑制率升高，即細胞增殖能力降低（均P＜0.05）；與PTL 組比較，PTL+Rapamycin 組細胞增殖抑制率升高，即細胞增殖能力降低（P＜0.05），PTL+3-MA 組細胞增殖抑制率降低，即細胞增殖能力升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 4組食管癌細胞增殖能力比較

2.3 PTL調控自噬對食管癌細胞遷移能力的影響 與NC 組比較，PTL 組、PTL+Rapamycin 組和PTL+3-MA 組穿膜細胞數明顯減少，即細胞遷移能力降低（均P＜0.05）；與PTL 組比較，PTL+Rapamycin 組穿膜細胞數明顯減少，即細胞遷移能力降低（P＜0.05），PTL+3-MA 組穿膜細胞數明顯增加，即細胞遷移能力升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 4組食管癌細胞遷移能力比較

2.4 PTL 抑制食管癌細胞體內生長 裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示，PTL 組成瘤體積為（140.57±13.54）mm3，明顯低于NC 組的（328.38±13.76）mm3（t=23.830，P=0.006）；PTL 組成瘤體重為（20.82±5.17）mg，明顯低于NC 組的（37.65±8.36）mg（t=23.830，P=0.006），見圖3。

圖3 裸鼠皮下成瘤實驗檢測Eca109細胞體內生長能力

2.5 PTL 對食管癌細胞Eca109 自噬相關蛋白表達的影響 與NC 組比較，PTL 組、PTL+Rapamycin組和PTL+3-MA 組P62、Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表達量均顯著升高（均P＜0.05）；與PTL 組比較，PTL+Rapamycin組P62、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），PTL+3-MA 組P62、Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 4組食管癌細胞自噬相關蛋白表達量比較

3 討論

目前新輔助療法、手術切除、放療和化學療法是食管癌患者的主要治療方法，但是食管癌患者的預后仍然不理想[4]。與肺癌、乳腺癌和結腸癌等惡性腫瘤不同，分子靶向治療已廣泛應用于臨床治療，目前尚未開發出專門針對食管癌的靶向療法[4]。中草藥在亞洲已經使用了數千年，不僅具有抗炎活性，并含有豐富的抗癌化合物，已長期用作抗腫瘤藥物，可在腫瘤微環境和腫瘤免疫中發揮直接的細胞毒性作用和間接調控作用，并改善化療藥物的副作用[10]。雙氫青蒿素等中草藥具有較低的毒性，能提高患者的生活質量，延長生存期[5,10]。

PTL屬于天然倍半萜內酯，包含α-亞甲基-γ-內酯環和環氧基團，使得其能夠與生物分子的親核位點相互作用，PTL一直被用作消炎和抗偏頭痛的特性草藥，最近其抗癌活性被逐漸發現[11]。PTL 可通過調控增殖和凋亡相關蛋白，用于抑制和治療尼古丁相關的肺癌[6]。在結直腸癌中，PTL 通過抑制間充質蛋白的表達抑制轉化生長因子-β1誘導的上皮間質轉化，最終導致腫瘤細胞的轉移和侵襲能力降低[7]。另有文獻報道，PTL 可減弱食管癌Eca109 和KYSE-510 細胞在體外的增殖、遷移和血管生成能力，以及抑制小鼠異種移植瘤生長[8]；并通過抑制NF-κB 信號通路，調控腫瘤生長、血管生成等相關基因的表達[11-12]。本研究發現，PTL呈濃度依賴性地抑制食管癌細胞Eca109增殖、遷移及裸鼠體內生長（P＜0.05）。

自噬是維持真核細胞內穩態的進化保守過程，在蛋白質和細胞器的降解和代謝中起主要作用。自噬是一把“雙刃劍”，在某些情況下會觸發腫瘤細胞的死亡，而有些研究顯示自噬增強腫瘤細胞生長能力[9]。中藥通過誘導自噬抑制惡性腫瘤的進展是其發揮抗癌作用的重要機制，研究報道，PTL 呈濃度依賴性地增加胰腺癌細胞自噬，誘導細胞凋亡[13]。PTL 通過誘導自噬在體內、外抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞的生長和遷移能力[14]。而自噬相關蛋白的改變是細胞自噬的關鍵，Beclin1基因是自噬必需的，其缺失等位基因在食管癌中被報道[15]。而自噬受體蛋白P62及自噬發生的執行者LC3II表達增加均促進細胞自噬[16-17]。本研究發現，PTL 促進P62、Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表達（P＜0.05），表明PTL 促進食管癌細胞的自噬。那么，PTL 是否通過調控細胞自噬抑制食管癌細胞的增殖和轉移能力？本組進一步采用自噬誘導劑Rapamycin及自噬抑制劑3-MA 與PTL 共同處理食管癌細胞，結果顯示，與Rapamycin 聯合干預細胞后，PTL 對食管癌細胞增殖和遷移能力的抑制作用增強；而與3-MA 共同干預細胞，PTL 對食管癌細胞增殖和遷移能力的抑制作用減弱（P＜0.05），表明PTL通過促進細胞自噬在食管癌中發揮抗癌作用。

綜上所述，PTL 通過促進細胞自噬抑制食管癌細胞的增殖和遷移及體內移植瘤生長，有望成為治療食管癌的新型藥物。