miR-154靶向調控GALNT7對人腦星形細胞瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響*

喬建新，劉 明，劉熙鵬，段升強

（河北北方學院附屬第一醫院神經外科，張家口 075000）

由星形膠質細胞所組成的腦星形細胞瘤是位于中樞神經系統常見的原發性腫瘤類型，在全球范圍內具有極高的死亡率[1]。目前，關于星形細胞瘤的主要治療方法是進行手術，其次是放療法和化療，但其預后仍不容樂觀。因此，有必要找到其新的治療方法以改善療效[2]。

miRNA 是小的非編碼單鏈RNA 分子，可通過與靶基因3'UTR 結合來調節基因和蛋白的表達，其失調可通過充當癌基因或抑癌基因參與癌癥的發生，目前有許多研究報道稱，miRNA 參與星形細胞瘤的發病機理[3]。miR-154作為miRNA的一種已被表明在腦星形細胞瘤患者血清和組織中表達顯著下調，且與患者預后不良相關[4]。N-乙酰氨基半乳糖轉移酶7（N-acetylgalactosaminyltransferase 7，GALNT7）作為N-乙酰-D-半乳糖胺轉移酶家族的成員之一，已被報道可通過多種信號通路影響神經膠質瘤細胞增殖、轉移能力[5]。miR-154 可通過抑制GALNT7 表達抑制喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞增殖、侵襲和遷移[6]。在腦星形細胞瘤中miR-154是否發揮同樣作用尚未可知。為此，本研究通過探討miR-154 對人腦星形細胞瘤（U251）細胞的增殖、遷移及侵襲的影響，以期為人腦星形細胞瘤新的靶向治療機制研究提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

胎牛血清、人腦星形細胞瘤U87、U251 細胞、pmirGLO 質粒、DMEM 培養基（貨號：164210-500、YCL-0238、YCL-0237、E1330、PM150210）購自武漢益普生物科技有限公司；人腦星形細胞瘤SHG44細胞（貨號：CL-0207）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；HEB 人腦膠質細胞（貨號：YS2890C）購自上海雅吉生物科技有限公司；Lipofectamine?2000 Transfection Reagent（貨號：11668027）購自賽默飛世爾科技；Matrigel膠（貨號：356234）購自上海善然生物科技有限公司；即用型熒光定量PCR 試劑盒（貨號：XY-TE-0731）購自上海烜雅生物科技有限公司；總RNA 提取試劑盒（貨號：AR1200-100T）購自上海吉至生化科技有限公司；QIAGEN 反轉錄試劑盒（貨號：QIAGEN）購自上海科敏生物科技有限公司；青霉素—鏈霉素（貨號：LM1200K）購自上海聯邁生物工程有限公司；胰酶溶液（貨號：PYG0065）購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人β-actin、GALNT7、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2 抗體（貨號：ab8227、ab97645、ab32072、ab16663、ab76003、ab37150）購自abcam；MTT 檢測試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗抗體（貨號：BTN111105、K12862、WE0381-QAN）購自北京百奧萊博科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號：CD-13559-ML）購自武漢純度生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：11402ES60）購自上海翊圣生物科技有限公司；無關序列miR-NC、miR-154 mimics由賽默飛世爾科技合成。QuantStudio 3&5實時熒光定量PCR（RT-qPCR）系統、iBright 蛋白免疫印跡成像系統購自賽默飛世爾科技；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞與培養

人腦星形細胞瘤U87、U251、SHG44 細胞及HEB人腦膠質細胞接種到DMEM培養基（10%胎牛血清）中后均置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。培養基兩天更換1 次，直至細胞融合至80%左右后用胰酶消化進行傳代培養。

1.2.2 RT-qPCR檢測各細胞株中miR-154的表達

用RNA 提取試劑盒提取U87、U251、SHG44 及HEB 細胞中總RNA 并反轉錄成cDNA 后通過RTqPCR檢測細胞株中miR-154表達水平。U6為內參并對mRNA 進行標準化，2-ΔΔCt分析miR-154 表達水平（n=5）。引物由Oligo 7 和Primer 3.0 軟件設計（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。

表1 RT-qPCR引物

1.2.3 細胞瞬時轉染

設置對照組，將對數生長期U251 細胞（1 mL）以2×105個/mL接種于6孔板中培養至細胞貼壁后，每組設置6 個復孔，按Lipofectamine?2000 說明書以終濃度為5 nmol/L分別將miR-NC、miR-154 mimics轉入相應組U251細胞中培養48 h。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力

設置對照組、miR-NC組、miR-154 mimics組，細胞轉染后以1×105個/孔的密度，重復5孔，每孔100 μL，在96孔板中培養至對數生長期。添加MTT 10 μL/孔（5 g/L），4 h后棄上清培養液加入DMSO 100 μL，震蕩至MTT 反應結晶充分溶解后，在570 nm 處測定吸光度OD值，計算U251細胞存活率（%）=（OD處理組/OD對照組）×100%。

1.2.5 平板克隆法檢測U251細胞增殖情況

各組U251細胞經0.25%胰酶消化，DMEM培養基（10%胎牛血清）終止消化后制備懸浮液并轉至培養皿中培養，直至克隆細胞肉眼可見，棄上清后15 min 多聚甲醛固定，20 min 結晶紫溶液（1%）染色，流水沖洗晾干后計數（n=5），克隆形成率（%）=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.2.6 Transwell法檢測U251細胞侵襲和遷移能力

侵襲實驗：用無血清DMEM培養基按1∶8稀釋4 ℃過夜融化的Matrigel（50 mg/L）膠后，包被Transwell小室上室，37 ℃過夜孵育1 h后將各組U251細胞調整濃度為2.5×105個/mL，取200 μL接種于小室上室，并在下室加入DMEM培養基500 μL培養24 h后PBS清洗，棉簽擦去上室未穿膜細胞，進行30 min甲醇固定、30 min 結晶紫溶液（0.1%）染色，隨機選取5 個視野內觀察穿膜細胞并計數。遷移：使用未被Matrigel 膠所包被的上室，除此之外與侵襲實驗相同。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測miR-154 與GALNT7的靶向關系

通過TargetScan(http://www.Targetscan.org/)確定miR-154與GALNT7結合位點后驗證二者靶向關系。將與miR-154 靶向序列相結合的GALNT7 的3'-UTR 片段經擴增、酶切和連接后，構建野生型和突 變 型GALNT7 載 體：pmirGLO-GALNT7-wt 和pmirGLO-GALNT7-mut。將接種于96 孔板的對數生長期U251細胞分為pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics 組、pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 組以及pmirGLO-GALNT7-mut+miR-154 mimics 組、pmirGLO-GALNT7-mut+miR-NC 組。按Lipofectamine?2000 說明書分別對各組細胞進行轉染48 h 后，使用雙重熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性：分別添加報告基因細胞裂解液（200 μL）和熒光素酶反應液（50 μL）檢測熒光強度A 后再加入反應終止液對熒光強度B 檢測進行，熒光素酶相對活性：A/B。

1.2.8 Western blotting 檢測U251 細胞中蛋白表達情況

使用RIPA 裂解液對U251 細胞進行裂解后，用BCA 蛋白試劑盒測定各組細胞總蛋白含量；SDSPAGE 電泳分離蛋白、低溫轉至PVDF 膜上，脫脂奶粉進行為時1 h的封閉，加入兔抗β-actin、GALNT7、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2（1∶1 000）一抗孵育（4 ℃）過夜后再用二抗（1∶5 000）孵育2 h，蛋白凝膠成像儀定量分析各蛋白含量（n=5）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組件比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-154在人腦星形細胞瘤U87、U251、SHG44細胞及HEB人腦膠質細胞中的表達情況

與HEB人腦膠質細胞（0.99±0.12）相比，人腦星形細胞瘤U251、U87、SHG44 細胞中miR-154 表達水平均顯著降低（0.35±0.09、0.56±0.11、0.61±0.10），并且在U251 細胞中其表達量最低（F=31.880，P＜0.001）（圖1），因此選擇U251細胞進行以下實驗。

圖1 miR-154在各細胞株中的表達情況

2.2 miR-154轉染效率檢測

與對照組比較，miR-NC 組U251 細胞中miR-154 表達水平無顯著變化（P＞0.05），miR-154 mimics 組其表達水平顯著增加（P＜0.05）（表2）。通過熒光顯微鏡觀察U251細胞轉染效果，見圖2。

表2 各組U251細胞中miR-154的表達水平比較n=5，

表2 各組U251細胞中miR-154的表達水平比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

圖2 熒光顯微鏡觀察結果（×200）

2.3 MTT法檢測miR-154對U251細胞增殖的影響

與對照組比較，miR-NC 組U251 細胞存活率無明顯變化（P＞0.05），miR-154 mimics組細胞存活率顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組U251細胞存活率比較n=5，

表3 各組U251細胞存活率比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

2.4 平板克隆法檢測miR-154 對U251 細胞增殖的影響

與對照組比較，miR-NC 組U251 細胞克隆數無明顯變化（P＞0.05），miR-154 mimics組細胞克隆數顯著降低（P＜0.05），見表4，圖3。

表4 各組U251細胞克隆數比較n=5，

表4 各組U251細胞克隆數比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

圖3 miR-154對U251細胞增殖的影響

2.5 miR-154對U251細胞侵襲遷移的影響

與對照組比較，miR-NC 組U251 細胞侵襲和遷移數無明顯變化（P＞0.05），miR-154 mimics組細胞侵襲和遷移數顯著減少（P＜0.05），見表5，圖4。

表5 各組U251細胞侵襲、遷移情況比較n=5，

表5 各組U251細胞侵襲、遷移情況比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

2.6 miR-154對U251細胞內增殖、侵襲和遷移相關蛋白的影響

與對照組比較，miR-NC組U251細胞內c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表達水平無明顯變化（P＞0.05），而在miR-154 mimics組其表達水平顯著降低（P＜0.05），見表6，圖4。

表6 各組U251細胞內增殖、侵襲和遷移相關蛋白的比較n=5，

表6 各組U251細胞內增殖、侵襲和遷移相關蛋白的比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

圖4 miR-154對U251細胞侵襲遷移的影響

2.7 U251 細胞中miR-154 與GALNT7 間的靶向關系

Http://microRNA.org 預測結果顯示出miR-154與GALNT7 間具有結合位點，GALNT7 是miR-154的潛在靶基因（圖6）。熒光素酶報告基因結果顯示：與pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 組相比，pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics 組熒光素酶活性顯著降低（t=5.890，P＜0.01）；其余組熒光素酶活性差異無統計學意義（t=0.234，P＞0.05）（圖7）。與對照組比較，NC 組GALNT7 表達水平無明顯變化（P＞0.05），miR-154 mimics組GALNT7表達水平顯著降低（P＜0.05），見表7、圖8。

表7 各組GALNT7蛋白表達水平比較n=5，

表7 各組GALNT7蛋白表達水平比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

圖5 miR-154對各組U251細胞內c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表達水平的影響

圖6 miR-154與GALNT7結合位點

圖7 熒光素酶活性檢測結果

圖8 miR-154對GALNT7蛋白表達的影響

3 討論

星形細胞瘤是中樞神經系統中最為常見的一種具有高侵襲性的高度惡性腦腫瘤，其源自于中樞神經系統的星形膠質細胞，占原發性腦腫瘤的60%以上，并且其早期體征和癥狀為非特異性[7-9]。目前針對星形細胞瘤治療的療效十分有限，而且由于當前治療的非特異性靶向性質，患者普遍復發率很高，因此，隨著現代科學技術的進步和醫學手段的提高，靶向治療越來越得到醫學工作者的重視[10]。

miRNA作為非編碼RNA已被證明參與癌癥的發生發展，并且越來越多的研究表明，miRNA 在癌癥發生過程中的重要性及其作為癌癥良好治療靶標的 適 用 性[10]。miR-101[11]、miR-128[12]、miR-224-3p[13]、miR-154[4]等多種miRNA被發現參與星形細胞瘤的發生發展。在星形細胞瘤患者組織和血清中miR-154 表達顯著降低，并且高表達患者預后較為良好，其低表達可能與星形細胞瘤的發生發展有關，且對該疾病具有一定診斷和預后評估的價值[4]。miR-154已被發現參與乳腺癌[14]、膠質母細胞瘤[15]等多種類型癌癥的發生發展過程，并且在其中表達異常降低。研究發現，miR-154-5p通過靶向抑制PIWI 樣蛋白1（Piwi-like protein 1，PIWIL1）表達來抑制膠質母細胞瘤的增殖和轉移[15]。miR-154通過靶向抑制Wnt5a表達而具有作為膠質母細胞瘤抑制因子的作用。本研究發現，miR-154 在星形細胞瘤U251細胞中表達水平均顯著降低，miR-154過表達可顯著抑制細胞存活率、細胞克隆數、侵襲和遷移數、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表達水平，結果表明，miR-154過表達可顯著抑制U251細胞的增殖、侵襲和遷移能力。

GALNT7 作為GALNT 家族成員之一，可調節癌細胞與細胞外環境的相互作用，其在宮頸癌[16]、結直腸癌[17]等多種類型的惡性腫瘤中表達上調，表明GALNT7參與腫瘤的發生，抑制其表達可使腫瘤消退[16]。LncRNA TP73-AS1 沉默可抑制神經膠質瘤細胞的增殖，促進其死亡，而外源性GALNT7 可逆轉TP73-AS1 對膠質瘤細胞增殖抑制的作用[18]。有幾項研究也表明，miR-125a-5p[15]、miRNA-30e[19]等多種miRNA 的可靶向調節GALNT7 的表達，在宮頸癌中miR-125a-5p 通過抑制EGFR/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（EGFR/ PI3K/AKT）途徑激活來使GALNT7表達下調，從而抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲[16]。在LSCC中，miR-154可通過抑制GALNT7表達抑制LSCC細胞增殖、侵襲和遷移[6]。本研究靶基因預測結果顯示，GALNT7 是miR-154 的潛在靶基因，與pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 組相比，pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics組熒光素酶活性顯著降低，并且miR-154 mimics組GALNT7表達水平顯著降低。結果表明，miR-154 過表達對U251 細胞增殖、侵襲和遷移的抑制可能與抑制GALNT7表達有關。

綜上所述，miR-154 過表達通過靶向抑制GALNT7 表達來抑制U251 細胞增殖、侵襲和遷移能力。本研究不僅對星形細胞瘤的新的靶向治療機制的研究具有重要價值，還為miR-154 在星形細胞瘤中的作用機制研究提供了參考，但在未來的研究中還需要對其下游通路進行研究，使其機制研究更為完善。