S100A6對黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響及機(jī)制研究*

劉 碩，常 謹(jǐn)，劉英琦

（1.河北邯鄲市第一醫(yī)院頜面外科，邯鄲 056002；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科，邯鄲 056000）

黑色素瘤是由黑色素細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而形成的。惡性黑色素瘤具有極強(qiáng)的侵襲力，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，治愈率及預(yù)后極差[1]。因此，尋找有效的治療黑色素瘤方法是目前的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。PI3K/Akt 信號(hào)通路是經(jīng)典的調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的通路[2]，可以通過調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖分化。PI3K/Akt 信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的血管形成、化療藥物耐藥、放療抵抗密切相關(guān)[3]。黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制、治療與PI3K/Akt 信號(hào)通路息息相關(guān)[4-5]，有研究顯示，Notch1 調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞生長[6]。S100A6屬于S100蛋白家族成員，它能與游離的鈣離子結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，可以參與細(xì)胞的增殖、凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程。已有研究表明，增加S100A6 表達(dá)可通過上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt的磷酸化促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞143B 增殖和遷移，添加PI3K 抑制劑（LY294002 或wortmannin）在一定程度上逆轉(zhuǎn)了S100A6 對143B 細(xì)胞中Akt 磷酸化的上調(diào)作用，同時(shí)，也逆轉(zhuǎn)了S100A6 表達(dá)對143B 細(xì)胞的影響[7]。但是，S100A6對黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的明確作用還尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，探討S100A6 對黑色素瘤細(xì)胞A375增殖、侵襲和遷移的影響，并初步分析其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人黑色素瘤細(xì)胞（A375 系）（貨號(hào)：CL-0014）購買于武漢普諾賽生命科技有限公司。胎牛血清、胰蛋白酶溶液（含酚紅，含0.25%EDTA）、RPMI 1640培養(yǎng)基（ATCC Modification）、DMEM 高糖培養(yǎng)基、opti-MEM 等，購自美國Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000 購自美國Thermo 公司；兔抗c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、PI3K、p-PI3K、GSK3β、AKT、p-AKT 多克隆抗體購自美國Abcam 公司；鼠抗人GAPDH 抗體購自北京全式金有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體購自美國CST；PI3K 抑制劑（LY294002）購自美國Sigma 公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒購自Takara；Platinum SYBR Green PCR試劑盒購自北京全式金有限公司；PVDF膜自Millipore；Transwell 小室購自Corning 公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD Bioscience公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取出凍存管，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞貼壁后，從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞瓶進(jìn)行換液，向培養(yǎng)瓶中加入適量的10%FBS DMEM 培養(yǎng)基置于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)。一般隔兩天換液1 次，待細(xì)胞長滿瓶壁85%左右進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 細(xì)胞分組及S100A6過表達(dá)載體的構(gòu)建

從GeneBank 中尋找S100A6 基因的編碼區(qū)（CDS）堿基序列（NM-014624.3），設(shè)計(jì)基因CDS 全長引物，PCR擴(kuò)增，經(jīng)BamH I和EcoR I酶切后，插入pcDNA3.0 真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切、PCR 和測序鑒定，構(gòu)建pcDNA3.0-S100A6 真核表達(dá)載體。將A375細(xì)胞接種于6孔板分4組：空白對照組、空載體對照組、S100A6 轉(zhuǎn)染組、S100A6 轉(zhuǎn)染+抑制劑組。空白對照組正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；空載體對照組使用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染S100A6 過表達(dá)空載質(zhì)粒pcDNA3.0，后使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；S100A6 轉(zhuǎn)染組使用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染S100A6 過表達(dá)載體pcDNA3.0-S100A6，后使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；S100A6 轉(zhuǎn)染+抑制劑組使用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-S100A6 使用含PI3K 抑制劑LY294002 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。選取各組處理的對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 RT-qPCR檢測S100A6 mRNA表達(dá)水平

細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)或處理后，PBS 洗一遍，加入Trizol 試劑進(jìn)行細(xì)胞總RNA 提取，然后通過兩步法轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green 進(jìn)行熒光定量PCR，以GAPDH 為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本做3 個(gè)重復(fù)孔。GAPDH 的上游引物序列5'-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3'，下游引物序列5'-TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC-3'；S100A6 的上游引物序列5'-ATGGCATGCCCCTGGATCAGG-3'，下游引物序列5'-TCAGCCCTTGAGGGCTTCAT-3'。RT-qPCR擴(kuò)增體系為10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，進(jìn)72 ℃延伸40 s 行35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用2-ΔΔct法計(jì)算S100A6 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)接種于96孔板中，每孔100 μL，在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)，加入10 μL的MTT溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO 震蕩混勻，用酶標(biāo)儀檢測492 nm 的OD 值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD值×100%。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移率

取傳代一致的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至l×106cell/mL 接種于6 孔板，采用10 μL 的微量加樣槍頭畫出無細(xì)胞區(qū)，顯微鏡下觀察并記0 h 劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后在同一位置觀察拍照記錄劃痕寬度，每組取3處計(jì)算其平均值。遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

按方法“1.3項(xiàng)”進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，并將BD基質(zhì)膠置于4 ℃冰箱以使其處于完全融化狀態(tài)。將Tranawell 小室放置24 孔板中，取60 μL Matrigel 鋪于小室濾膜上，37 ℃培養(yǎng)箱中凝膠1 h，吸取上室多余液體加入200 μL無FBS的DMEM，37 ℃培養(yǎng)箱1 h水化基底膜以備用。在24孔板下室中加入500 μL含10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)液，基質(zhì)膠包被Tranawell 小室中加入100 μL各組細(xì)胞懸液（細(xì)胞總數(shù)約2×105個(gè)）；48 h后棄去24孔板下室中的培養(yǎng)基，在下室中加入600 μL 甲醇固定20 min，棄去甲醇加入600 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，使用棉簽擦去上室細(xì)胞，室溫下干燥，最后在顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，記錄每個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 Western blotting檢測PI3K/Akt信號(hào)通路及增值、侵襲相關(guān)蛋白

細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)和處理后24 h 進(jìn)行蛋白收取，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白變性，調(diào)整蛋白濃度進(jìn)行電泳，空白孔用1×Loading buffer 補(bǔ)齊，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗分別用PI3K、p-PI3K、GSK3β、Akt、p-Akt、c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 抗體以1∶500 進(jìn)行4 ℃過夜孵育，二抗分別用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）抗體室溫孵育2 h，ECL顯影，用凝膠成像儀獲取圖像，并對圖像進(jìn)行灰度分析（Image Lab 軟件）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組與組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定過表達(dá)S100A6 黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375 構(gòu)建

與空白對照組相比，空載體對照組中S100A6 mRNA 水平不變（P＞0.05）；與空白對照組、空載體對照組比較，S100A6 轉(zhuǎn)染組中S100A6 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與S100A6 轉(zhuǎn)染組相比，S100A6轉(zhuǎn)染+抑制劑組中S100A6 mRNA水平不變（P＞0.05），見圖1。

圖1 RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中S100A6 mRNA相對表達(dá)水平

2.2 過表達(dá)S100A6對細(xì)胞增殖影響

與空白對照組相比，空載體對照組細(xì)胞增殖抑制率無明顯差異（P＞0.05）；與空白對照組、空載體對照組比較，S100A6 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05）；與S100A6轉(zhuǎn)染組相比，S100A6轉(zhuǎn)染+抑制劑組細(xì)胞存活率下降（（P＜0.05），見圖2。

圖2 MTT法檢測各組細(xì)胞存活率情況

2.3 過表達(dá)S100A6對細(xì)胞侵襲影響

與空白對照組相比，空載體對照組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；與空白對照組、空載體對照組比較，S100A6 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與S100A6轉(zhuǎn)染組相比，S100A6轉(zhuǎn)染+抑制劑組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)顯著下降（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細(xì)胞侵襲情況分析

2.4 過表達(dá)S100A6對細(xì)胞遷移影響

與空白對照組相比，空載體對照組細(xì)胞遷移率無顯著差異（P＞0.05）；與空白對照組、空載體對照組比較，S100A6 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率顯著升高（P＜0.05）；與S100A6轉(zhuǎn)染組相比，S100A6轉(zhuǎn)染+抑制劑組細(xì)胞遷移率顯著下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細(xì)胞遷移情況分析

2.5 過表達(dá)S100A6對PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

與空白對照組相比，空載體對照組p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、GSK3β 蛋白濃度無顯著差異（P＞0.05）；與空白對照組、空載體對照組比較，S100A6 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、GSK3β 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與S100A6 轉(zhuǎn)染組相比，S100A6 轉(zhuǎn)染+抑制劑組細(xì)胞p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、GSK3β顯著降低（（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況分析

2.6 過表達(dá)S100A6 對細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)影響

與空白對照組相比，空載體對照組c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白濃度沒有顯著變化（P＞0.05）；與空白對照組、空載體對照組比較，S100A6轉(zhuǎn)染組細(xì)胞c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與S100A6轉(zhuǎn)染組相比，S100A6 轉(zhuǎn)染+抑制劑組c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 細(xì)胞蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)情況分析

3 討論

惡性黑色素瘤可從原發(fā)病灶轉(zhuǎn)移，從而形成繼發(fā)性的腫瘤組織，不能有效通過手術(shù)治療，預(yù)后效果極差，長期生存率小于10%[8]。因此，黑色素瘤的治療難度高，尋找高效的藥物和治療手段成為研究熱點(diǎn)。

S100A6 最初由Kuznicki 等[9]在Ehrlich 腹水瘤中檢出，屬于S100 鈣離子結(jié)合蛋白家族，當(dāng)它結(jié)合鈣離子后隨即發(fā)生蛋白構(gòu)象改變，使其經(jīng)典的EF手型結(jié)構(gòu)得以暴露，該EF手型結(jié)構(gòu)可以與多種靶蛋白結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，S100A6在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，并促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[10]。S100A6 蛋白通過抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制Calu-6 肺癌細(xì)胞生長[11]。S100A6 表達(dá)與患者的年齡及腫瘤分化有密切的關(guān)系，并且可以根據(jù)S100A6 基因的表達(dá)來判斷肺鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的效果[12]。S100A6 通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制成骨細(xì)胞分化來加速人類骨肉瘤的生長[13]。但是S100A6 在黑色毒瘤細(xì)胞中的分子機(jī)制尚不清楚。因此，探討S100A6在黑色毒瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響，有望為該病的診斷及治療提供潛在的標(biāo)志物和靶標(biāo)。c-Myc 與CyclinD1 屬于細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，二者蛋白水平可在一定程度上反映細(xì)胞的增殖能力[14]；MMP-2 和MMP-9 屬于MMPs 家族，是一種高度保守的鋅離子依賴性蛋白水解酶，可通過降解上皮基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移[15]。本研究通過過表達(dá)S100A6，發(fā)現(xiàn)S100A6 過表達(dá)顯著促進(jìn)了黑色素瘤細(xì)胞增殖活力、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)；c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9增殖、侵襲蛋白表達(dá)水平也顯著升高，與以上實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。表明S100A6過表達(dá)可能通過上調(diào)c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

PI3K/Akt 通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，PI3K 是一種脂質(zhì)激酶，可傳播細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，Akt是PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的重要下游效應(yīng)器，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等在內(nèi)的多種途徑。GSK3β 是PI3K/Akt 信號(hào)通路的關(guān)鍵下游底物和效應(yīng)物，Akt 可以通過磷酸化GSK3β 而抑制其活化[16]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，S100A6對肝癌細(xì)胞增殖、遷移的促進(jìn)效應(yīng)依賴于PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。Ke 等[18]發(fā)現(xiàn)，c-Src 可以通過PI3K/Akt 通路誘導(dǎo)EMT，從而促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。腎上腺素通過PI3K/Akt信號(hào)通路的失活抑制黑色素瘤A375細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[19]。有研究表明，S100A6可以通過PI3K/Akt 信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移[20]。因此，我們推測PI3K/Akt 通路可能也參與介導(dǎo)S100A6 促黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，在黑色素瘤細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-S100A6 質(zhì)粒后p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GSK3β顯著增加，表明它可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路。但是當(dāng)加了PI3K/Akt 信號(hào)通路的抑制劑時(shí)出現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，說明S100A6可能通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路進(jìn)而影響c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達(dá)，從而調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，S100A6 可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，其促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移作用機(jī)制可能是通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。但是，此次試驗(yàn)并沒有對其它通路進(jìn)行排除，并未通過下調(diào)S100A6表達(dá)進(jìn)行反向驗(yàn)證，且并未在動(dòng)物模型體內(nèi)驗(yàn)證本研究結(jié)論，故存在一定的局限性，還需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。