miR-29a基于BMP2/Runx2對肋骨骨折大鼠的干預作用*

張秀燕，王 強，孫曉娟，田 樂，高 蕾，王海濱，高書軍△

（張家口市第二醫院 1.手麻科；2.骨科，張家口 075000）

肋骨骨折是鈍性胸外傷后最常見的損傷，約占所有鈍性胸外傷人群的50%[1]。肋骨骨折可增加患者肺部感染和死亡的風險，尤其是在老年人群中[2]。過去的幾十年中，在肋骨骨折患者的護理方面取得了巨大的進步，但患者的預后仍然很差[3]，因此亟待研發出新的治療策略。骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是TGF-β超家族成員，能夠刺激間充質骨祖細胞向成骨細胞成熟[4]。矮小相關轉錄因子2 (runt-related transcription factor 2，Runx2)，也稱為核心結合因子α 亞基1（core-binding factor subunit alpha-1，CBF-alpha-1），由Runx2 基因編碼，Runx2 是調控成骨細胞分化的關鍵轉錄因子[5-6]。BMP2和Runx2轉錄因子均能夠刺激成骨細胞分化和骨形成[1]。有文獻報道，BMP2可以通過激活Smad 蛋白來刺激包括Runx2 在內的許多靶基因的表達而發揮作用[7]。此外，Runx2通過直接結合靶基因中的增強子區域來誘導成骨細胞特異性基因表達[1]。

miR-29 家族是一種骨骼和肌肉發育密切相關的miRNA，能夠調控成骨細胞的增殖和分化[8]，由miR-29a、miR-29b 和miR-29c 組成。研究發現，miR-29b-3p通過靶向調控BMP1抑制骨折后的愈合過程[9-10]。本研究通過構建大鼠肋骨骨折，探討miR-29對BMP2/Runx2的調控作用及其對骨折愈合的影響，為促進臨床骨折愈合提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只10周齡SPF級雄性SD大鼠，體重（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2014-0001。

1.2 肋骨骨折大鼠模型的建立與動物分組 異氟烷麻醉大鼠，取左側臥位，捫及第六肋骨，分層切開皮膚、皮下組織和肌肉，剝離骨膜，顯露肋骨并橫向剪斷，使肋骨自由移動，對位分層縫合[11]。術后1 d，將大鼠隨機分為對照組和miR-29 組，每組20 只。miR-29 組在骨折斷端，使用微量注射器注射30 μL miR-29 mimic（購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司，終濃度1.67 μg/μL，溶于生理鹽水），對照組注射等量生理鹽水。

1.3 Micro-CT 掃描 造模14 d、28 d 后，每組分別處死10 只大鼠，X 線片觀察大鼠肋骨愈合情況。Micro-CT掃描檢測各組肋骨顯微結構參數，掃描條件為：圖像矩陣為2 048×2 048，整合時間為200 ms，能量/強度為70 kVp、114 μA、8 W，以0°旋轉，進行掃描。掃描結束后用Micro-CT 自帶的軟件進行定量分析，指標包括骨密度、骨礦物質含量及骨骼體積比。

1.4 Western blotting法檢測Runx2和BMP2蛋白表達 取大鼠肋骨骨痂組織，加入組織裂解液充分研磨，離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液（1∶4）煮沸使蛋白變性，每孔加入30 μg樣品或5 μL Marker 進行SDS-PAGE，濃縮膠電壓75 V，30 min，分離膠電壓120 V，60 min；轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜；一抗Runx2、BMP2、β-actin（均1∶1 000，Abcam，英國）4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜；山羊抗兔IgG 二抗（1∶3 000，Abcam，英國）室溫孵育30 min，洗膜；ECL 顯色，曝光。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測Runx2和BMP2 mRNA 相對表達量 Trizol 法提取肋骨骨痂組織樣本總RNA，nanodrop 測定RNA 濃度，逆轉錄為cDNA，進行PCR 擴增。PCR 反應體系為20 μL：上游和下游引物各(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 2.0 μL，SYBRTM Premix Dimer Eraser(2×)10 μL，ddH2O 4.0 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火、延伸各20 s，共40 個循環。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，引物序列如下，BMP2 上游：5'-TGCACCAAGATGAACACAGC-3'，下游：5'-GTGCCACGATCCAGTCATTC-3'；Runx2 上游：5'-CCATAACGGTCTTCACAAATCCT-3'，下游：5'-TCTGTCTGTGCCTTCTTGGTTC-3'；miR-29a上游：5'-ACAGACTCATTCCATTGTGC-3'，下游：5'-CCACATGCAATTCAGGTCAG-3'；β-actin上游：5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，下游：5'-TACATGGCTGGGGTGTTGA-3'，U6 上游：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，下游5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.6 統計學方法 采用SPSS 27.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示。組內和組間進行兩兩比較時，若滿足正態分布且方差齊性采用Student'st檢驗；若服從正態分布但方差不齊，則用Welch'st-test；若非正態分布，則用Mann-WhitneyUtest，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠一般情況比較 miR-29組20只大鼠均成活并造模成功；對照組20 只大鼠均造模成功，未發生死亡。所有大鼠術后第1 天活動自如，進食及飲水正常。術后1 周傷口局部紅腫逐漸消退，無滲液。

2.2 骨組織愈合情況比較 X線片顯示，自14 d開始，兩組均有骨痂開始形成，至28 d骨痂塑形改建，說明隨著時間推移兩組的骨折均有不同程度的愈合。兩組X線片圖像顯示，14 d時miR-29組骨痂形成較對照組明顯增加。隨時間推移兩組骨折線均逐漸變模糊，28 d時對照組骨痂塑形完成，骨干趨于正常，骨密度均勻，而miR-29 組愈合情況明顯優于對照組（圖1）。此外，Micro-CT結果顯示，兩組大鼠的骨密度、骨礦物質含量及骨骼體積比均隨時間逐漸增加（P＜0.05），與對照組相比，miR-29 組骨密度、骨礦物質含量及骨骼體積比均顯著增加（P＜0.05），見圖2。

圖1 不同時間點大鼠胸部X線片

圖2 不同時間點大鼠肋骨微結構變化

2.3 兩組不同時間Runx2 和BMP2 mRNA 相對表達量比較 與對照組相比，miR-29 組miR-29、Runx2 和BMP2 mRNA 相對表達量均明顯升高（均P＜0.05），兩組肋骨骨折28 d 時miR-29、Runx2 和BMP2 mRNA 相對表達量均較14 d 時明顯下降（均P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組不同時間miR-29、Runx2及BMP2 mRNA相對表達量比較

2.4 兩組Runx2 及BMP2 蛋白表達水平比較 與對照組比較，miR-29 組Runx2 及BMP2 蛋白表達量均明顯升高（均P＜0.05），兩組肋骨骨折28 d 時Runx2 和BMP2 蛋白表達量均較14 d 時明顯下降（均P＜0.05），見圖4。

圖4 不同時間點大鼠肋骨中Runx2及BMP2的蛋白量變化

3 討論

骨形成是指未分化的前體細胞在損傷發生后趨化集中到損傷部位，并在Smad蛋白、BMP家族等轉錄因子的刺激作用下分化為成骨細胞并合成膠原，最終形成新的骨組織的過程。成骨分化過程受到諸多轉錄因子起的調控，Runx2 和BMP2 作為最主要的成骨分化轉錄因子，調控多種成骨標志性基因的表達，是骨形成中的關鍵信號通路[12-13]。已有文獻報道，BMP2可以通過激活Smad蛋白和其他信號轉導途徑來刺激包括Runx2在內的許多靶基因的表達而發揮作用，其具體機制為，BMP 信號傳導首先通過配體與Ⅰ型和Ⅱ型BMP受體結合而激活，并由Smad 經典通路或者絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑進行轉導[14-15]。本研究結果表明，肋骨骨折后BMP2、Runx2信號通路激活，誘導前成骨細胞成骨分化和刺激成骨細胞增殖，從而促進骨痂形成和基質礦化。此外，本研究結果顯示，肋骨骨折28 d 時兩組BMP2、Runx2表達量均明顯下調（P＜0.05），表明在骨折愈合末期，骨痂形成和基質礦化已趨于完成，BMP2/Runx2信號通路逐漸恢復非激活水平。

miRNA是在植物、動物和某些病毒中普遍存在的單鏈非編碼RNA分子，長度約20個核苷酸，主要參與了基因的轉錄后沉默，被發現在多種骨科疾病過程中起到核心調控作用[16]。其中，miR-29家族是研究最為廣泛的miRNA之一。miR-29家族由miR-29a、miR-29b 和miR-29c 組成，miR-29a 主要分布于細胞質，而miR-29b 和miR-29c 主要分布于細胞核中，發揮不同的生理病理功能[17-18]。Zhang等[9]發現，miR-29b-3p 結合于BMP1 的3'UTR 區從而降低其mRNA 水平，抑制骨髓間充質干細胞的成熟和分化；另一項研究顯示，miR-29b-3p 可以促進骨痂礦物質沉積、提高骨小梁的體積，因而有利于骨折的愈合[19]。miR-29在骨折愈合中的作用十分復雜，其干預時期和所表達的組織細胞不同，在骨折愈合中可能會產生不同的作用。此外，在脆性骨折中，miR-29a和miR-29b在患者的血液中低表達，且與骨密度呈正相關關系[20]。在破骨細胞中特異表達miR-29a，可以抑制核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）和趨化因子CXCL12的表達，從而抑制破骨細胞的分化成熟，有利于骨骼中礦物質的沉積和骨小梁的形成[21]。最后，miR-29a 還可以通過ERK/MAPK 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進成骨細胞的分化成熟；另一方面，miR-29a受Wnt/βcatenin 通路的調控，在其激活后高表達，因而miR-29a 可與Wnt/β-catenin 形 成正反饋調節 環路[22-23]。但miR-29a 與BMP2/Runx2 的crosstalk在肋骨骨折中的作用還不明確。本研究通過局部過表達miR-29a，發現其能促進BMP2/Runx2 的表達和蛋白量，從而促進骨痂形成、提高骨密度而發揮促進骨折愈合的作用。

綜上，miR-29a能夠促進大鼠肋骨骨折的恢復，其作用機制與BMP2/Runx2 通路有關，但其具體作用靶點有待進一步的研究。