Bmi-1基因在調(diào)節(jié)牙本質(zhì)及牙槽骨形成和發(fā)育中的作用及機(jī)制研究

黃元清 李斌 魏敏 肖嬋 劉麗

中圖分類號(hào):R780.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.003

牙齒的形成是各種分子從起始到終末分化的精確協(xié)調(diào)過程，牙齒發(fā)育還包括一系列有序的誘導(dǎo)信號(hào)，對(duì)細(xì)胞增殖、分化和器官發(fā)生發(fā)揮全局控制作用[1-3]。下頜骨的發(fā)育始于下頜突第一鰓弓的出現(xiàn)，然后形成梅克爾軟骨。除髁突之外，其余下頜骨均經(jīng)歷膜內(nèi)成骨，成骨的一系列因素依賴于不同因素[4-5]。牙槽骨增大也是通過膜內(nèi)成骨過程發(fā)生的，在此過程中，骨軟骨祖細(xì)胞依次經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)誘導(dǎo)、增殖和分化[6]。目前，對(duì)出生后小鼠牙齒和下頜骨生長(zhǎng)發(fā)育的分子基礎(chǔ)了解甚少。

B細(xì)胞淋巴瘤濾過性病毒插入位點(diǎn)1 (B cell-specific moloney leukemia virus insert site-1,Bmi-1) 基因?qū)儆诰哿虻鞍讖?fù)合體基因家族(polycomb group,PcG)的成員之一，具有轉(zhuǎn)錄抑制劑的作用，對(duì)生物體發(fā)生過程中基因的正確表達(dá)起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[7]。研究證實(shí)，Bmi-1基因缺失小鼠表現(xiàn)出包括骨質(zhì)疏松[8]在內(nèi)的全身過早衰老表型。Bmi-1對(duì)下游通路的調(diào)節(jié)主要通過兩條通路來實(shí)現(xiàn)，一是通過介導(dǎo)的INK4a/Arf位點(diǎn)的降低P53水平完成對(duì)細(xì)胞周期分子機(jī)制的調(diào)控；其次是通過減少線粒體ROS水平的產(chǎn)生，從而間接地參與DNA損傷修復(fù)的作用。抗氧化劑在很大程度上糾正了Bmi-1缺陷小鼠引起的胸腺細(xì)胞和腎臟發(fā)育缺陷[9-10]。考慮到牙釉質(zhì)生成、頜骨膜內(nèi)成骨與長(zhǎng)骨軟骨成骨之間的差異，尚不清楚Bmi-1缺乏是否會(huì)通過擾亂氧化還原穩(wěn)態(tài)和誘導(dǎo)牙槽骨DNA損傷而導(dǎo)致發(fā)育過程中的牙本質(zhì)和牙槽骨缺損。

為了探討B(tài)mi-1在牙本質(zhì)和牙槽骨發(fā)育中的潛在作用，取 3周齡Bmi-1基因敲除(BKO)小鼠15 只給予普通飲食4 周，取同窩野生型小鼠(WT)15 只進(jìn)行對(duì)照，通過影像學(xué)、組織病理學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)的方法比較分析兩組動(dòng)物之間牙齒及牙槽骨相關(guān)指標(biāo)之間差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的繁殖及基因鑒定 將Bmi-1雜合子(Bmi-1+/-，BKO)小鼠(129Ola/FVB/N雜交背景)與C57BL/6J背景進(jìn)行10～12 次回交，交配產(chǎn)生Bmi-1純合子(Bmi-1-/-, BKO)及其野生型(WT)。小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究嚴(yán)格按照南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所的指導(dǎo)方針進(jìn)行。本研究的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過了南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào): BK2006576)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng) 取子代小鼠WT和BKO小鼠將分別給予以下不同處理：正常飲食(WT)組(15 只)：子代小鼠3 周齡斷奶后，普通飲食(含1%鈣、0.67%磷)飼養(yǎng)WT小鼠4 周。正常飲食(BKO)組(15 只)：子代小鼠3 周齡斷奶后，普通飲食(含1%鈣、0.67%磷)飼養(yǎng)BKO小鼠4 周。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材 取7 周齡WT、BKO小鼠，麻醉后立即行頸椎脫臼處死，取同側(cè)牙及下頜骨，使用能更好保存酶活性和組織抗原性的甲醛混合物(2%副醛,75 mmol/L賴氨酸,10 mmol/L過碘酸鈉,Paraldehyde,Lysine,Sodium periodate,PLP) 固定液固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，用于HE染色、組織化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2 X線攝影觀察 固定后的牙及下頜骨使用Faxitron Model 805 radiographic檢測(cè)系統(tǒng)(Faxitron Contact, Germany; 22 kV and 4-minute exposure time)進(jìn)行X線攝影，觀察骨骼形態(tài)和骨密度的改變。

1.2.3 Micro-CT掃描和三維重建 取固定后的牙及下頜骨，進(jìn)行Micro-CT掃描(電壓100 kV，電流98 mA，SKY SCAN 1072，Bruker公司，德國(guó))和三維重建，選擇經(jīng)中切牙、第一磨牙、第二磨牙和第三磨牙斷面進(jìn)行比較分析觀察。

1.2.4 HE染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木精(Sigma公司,美國(guó))染色，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍(lán)，伊紅(Sigma公司,美國(guó))復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.5 組織化學(xué)染色 取下頜骨組織的石蠟切片，作總膠原蛋白(total collagen,TCOL)、堿性磷酸酶(akaline phosphatase,ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphates,TRAP)等組織化學(xué)染色。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 取牙及下頜骨組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋切片，作免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)指標(biāo)包括反映成骨和成牙本質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的指標(biāo)：骨鈣素(OCN)，I型膠原蛋白(Col I)，雙糖鏈蛋白多糖(Biglycan)，牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSP)。

1.2.7 牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和細(xì)胞化學(xué)染色 取3 周齡下頜牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells,BMSCs)進(jìn)行培養(yǎng)后，用PBS洗滌，加入冷乙醇固定。固定后，按順序?qū)A性磷酸酶(ALP)陽性菌落、鈣化菌落、膠原陽性菌落和總菌落進(jìn)行染色。每個(gè)染色步驟結(jié)束后，對(duì)培養(yǎng)皿拍照、去漬、按要求留置。總成纖維細(xì)胞菌落(CFU-f)菌落的數(shù)量是用人工計(jì)算的。ALP染色陽性的菌落被認(rèn)為是來自具有表達(dá)ALP能力的CFU-f，并被稱為CFU-f ALP。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)工具應(yīng)用SPSS 14.0版軟件包，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(取雙側(cè))，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bmi-1對(duì)下頜骨牙槽骨礦化的影響

為了確定BKO小鼠是否會(huì)導(dǎo)致牙齒和下頜生長(zhǎng)遲緩，通過X線攝影和Micro-CT斷層攝影對(duì)兩組小鼠牙齒和下頜生長(zhǎng)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，BKO小鼠牙齒和下頜骨的骨密度(BMD)較低(圖1A)。中切牙、第一、第二、第三磨牙顯微CT掃描切片顯示，與WT小鼠相比，BKO小鼠的切牙和磨牙礦化程度以及下頜骨皮質(zhì)骨和牙槽骨體積均減小(圖1B)。

2.2 Bmi-1對(duì)牙齒、皮質(zhì)骨和牙槽骨容量的影響

為確定Bmi-1缺失是否會(huì)導(dǎo)致牙齒、皮質(zhì)骨和牙槽骨容量的減少，通過HE和TCOL染色分析BKO和同窩WT小鼠下頜骨的表型差異。如圖2所示，與WT小鼠相比，BKO小鼠的牙本質(zhì)(礦化和非礦化)厚度和牙槽骨體積均減小(圖1C～D)；BKO小鼠第一磨牙的牙本質(zhì)厚度(圖1E)、皮質(zhì)骨厚度(圖1F)和牙槽骨容量(圖1G)均較WT組顯著降低。

圖2 Bmi-1對(duì)前期牙本質(zhì)成熟和牙本質(zhì)形成的影響(×400)

2.3 Bmi-1對(duì)前期牙本質(zhì)成熟和牙本質(zhì)形成的影響

HE染色切片顯示，與同WT小鼠相比，BKO小鼠第一磨牙的前期牙本質(zhì)面積占比明顯增加(圖2A、2D)。在前期牙本質(zhì)區(qū)域檢測(cè)到biglycan陽性免疫反應(yīng)(圖2B)。與WT小鼠相比，BKO小鼠第一磨牙中biglycan陽性區(qū)域占牙本質(zhì)的比例明顯增加(圖2E)。在第一磨牙的前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)中檢測(cè)到DSP陽性免疫反應(yīng)(圖2C)。與WT小鼠相比，BKO小鼠第一磨牙中DSP陽性區(qū)域顯著減少(圖2F)。

2.4 Bmi-1對(duì)牙槽骨成骨細(xì)胞骨形成的影響

為檢測(cè)Bmi-1對(duì)牙槽骨成骨細(xì)胞骨形成的影響，采用HE染色、ALP染色、Col I和OCN免疫組化染色分析牙槽骨成骨細(xì)胞數(shù)量。如圖3結(jié)果顯示，與BKO小鼠相比，WT小鼠牙槽骨中成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞數(shù)量區(qū)域、ALP、Col I和OCN陽性區(qū)域顯著增加。

圖3 Bmi-1對(duì)成骨細(xì)胞骨形成的影響(×400)

2.5 Bmi-1對(duì)牙槽骨破骨細(xì)胞骨吸收的影響

為了測(cè)定Bmi-1對(duì)牙槽骨破骨細(xì)胞吸收的影響，采用TRAP染色法分析牙槽骨破骨細(xì)胞的數(shù)量。如圖4結(jié)果顯示，與BKO小鼠相比，WT小鼠牙槽骨中破骨細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)量、破骨細(xì)胞陽性細(xì)胞區(qū)明顯減少。上述結(jié)果表明，Bmi-1降低了破骨細(xì)胞骨吸收能力。

圖4 Bmi-1對(duì)成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收的影響(TRAP, ×200)

2.6 Bmi-1對(duì)CFU-F形成效率及牙槽骨BMSC分化的影響

為了闡明所觀察到的成骨細(xì)胞數(shù)量減少是否由于BKO小鼠成骨細(xì)胞功能缺陷，對(duì)3 周齡的BKO小鼠及其同窩WT小鼠進(jìn)行骨髓培養(yǎng)。與WT小鼠相比，BKO培養(yǎng)產(chǎn)生CFU-Fs和ALP陽性CFU-fap菌落的能力明顯受損(圖5)。

圖5 Bmi-1對(duì)CFU-F形成效率及牙槽骨BMSC分化的影響

3 討 論

Bmi-1來源于多疏基因家族，具有抑制Hox基因在生長(zhǎng)發(fā)育中的空間特異性和時(shí)間特異性表達(dá)的作用。Bmi-1基因缺失導(dǎo)致壽命縮短，生長(zhǎng)遲緩[11]。Zhang等[12]研究表明，Bmi-1基因敲除小鼠可誘導(dǎo)衰老相關(guān)骨質(zhì)疏松癥，主要是通過下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新。本研究通過對(duì)Bmi-1缺陷小鼠牙及下頜骨的表型分析發(fā)現(xiàn)，牙及下頜骨的骨密度、礦化皮質(zhì)骨和牙槽骨體積、成骨細(xì)胞數(shù)量、成骨細(xì)胞ALP活性的表達(dá)均降低。前期研究表明抗氧化劑吡咯喹啉醌(PQQ)可以顯著改善Bmi-1缺失小鼠的長(zhǎng)骨缺損[8]以及抵抗腮腺輻射損傷的作用[12]。因此，這些結(jié)果表明，Bmi-1基因的缺失干擾了長(zhǎng)骨和下頜骨成骨細(xì)胞的骨形成作用。

牙齒和下頜骨的成骨方式屬于膜內(nèi)成骨，長(zhǎng)骨的成骨方式屬于軟骨成骨。鑒于此，提出Bmi-1是否也在抵抗由Bmi-1缺失引起的牙齒和下頜骨缺損中發(fā)揮重要作用的假說。本研究結(jié)果顯示，與同窩WT小鼠相比，Bmi-1缺失小鼠的第一磨牙前期牙本質(zhì)以及biglycan占比均顯著增加。DSP在形成牙本質(zhì)的膠原基質(zhì)中的分布表明該蛋白在調(diào)節(jié)礦物沉積方面發(fā)揮著重要作用。結(jié)果還顯示，Bmi-1缺失小鼠的DSP免疫陽性區(qū)域減少，這與牙本質(zhì)厚度減少一致。因此，上述研究結(jié)果表明，Bmi-1基因缺陷會(huì)損害牙本質(zhì)的形成和礦化，因此，Bmi-1可以促進(jìn)牙本質(zhì)的形成和礦化。

本研究還發(fā)現(xiàn)BKO小鼠CFU-F形成效率明顯降低，牙槽骨BMSC的增殖減少，傳代的牙槽骨BMSCs在Bmi-1缺陷小鼠細(xì)胞培養(yǎng)中無法增殖。以上結(jié)果表明，Bmi-1在牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高效自我更新中也起著重要作用。在之前的[13]研究中，在明確的體內(nèi)外條件下，一定比例的CFU-F可形成多種間充質(zhì)組織，包括骨、脂肪組織、軟骨、骨髓支持間質(zhì)、平滑肌、心肌細(xì)胞和肌腱。因此，BMSC自我更新的缺陷不僅可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松表型，而且可能導(dǎo)致多組織生長(zhǎng)遲緩。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bmi-1基因敲除小鼠誘導(dǎo)了下頜骨骨質(zhì)疏松以及牙齒發(fā)育障礙，并證實(shí)了Bmi-1基因主要通過增加下頜骨成骨細(xì)胞骨形成、減少破骨細(xì)胞骨吸收、促進(jìn)前期牙本質(zhì)發(fā)育成熟等途徑發(fā)揮保護(hù)作用。為下一步深入Bmi-1基因調(diào)節(jié)骨微環(huán)境機(jī)制研究提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。