可注射型富血小板纖維蛋白治療口腔黏膜創傷性潰瘍的動物研究

李維芝 鄭柳紅 宗娟娟

中圖分類號:R781.5 文獻標志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.005

口腔黏膜疾病中有很多表現為反復發作的口腔黏膜糜爛/潰瘍，如復發性口腔潰瘍和糜爛型口腔扁平苔蘚等。此類疾病往往病因不明，反復發作，難以根治。目前治療此類病損的方法多是局部應用糖皮質激素[1]，但長期反復使用會帶來諸多不良反應，如黏膜萎縮變硬、真菌感染、停藥反跳等[2]。富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin，PRF)，因其在抗感染、促進組織愈合與再生方面的優勢[3]，近十多年來在臨床醫學各專業領域得到廣泛應用[4-5]。本課題嘗試將可注射型富血小板纖維蛋白(i-PRF)應用于口腔潰瘍病損的治療，并與糖皮質激素局部注射的療效相比較，以嘗試探索一種新的可行的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

由長沙市天勤生物技術有限公司提供新西蘭兔48 只，1.5～2.0 kg，雌雄各半，動物許可證號：SCXK(湘)2014-0010。飼養溫度(25±2) ℃,通風良好,預飼養1 周。鹽酸奧布卡因凝膠(沈陽綠洲制藥股份有限公司)；曲安奈德溶液(浙江仙琚制藥責任有限公司)；乙酸(西隴科學股份有限公司)；EOS7D相機(佳能公司，日本)；普通光學顯微鏡(Olympus公司，日本)；石蠟切片機(Leica Microsystems Nussloch Gmbh公司，德國)。

1.2 建模及分組

預飼養1 周后，目標位置碘伏消毒，涂表麻膏，將浸有15 μL 50%乙酸直徑為6 mm的圓形濾紙片置于兔上前牙牙齦處1 min[6]，生理鹽水沖洗1 min，24 h后可見潰瘍。建模成功的48 只新西蘭兔按隨機數法隨機分為4 組：i-PRF組、曲安奈德組(TA)、生理鹽水組(NS)、空白對照組(BC)。

1.3 i-PRF制備及給藥

建模24 h后,自i-PRF組兔子耳緣靜脈取5 mL血液，700 r/min離心3 min，i-PRF取出備用。每組兔口內消毒，表麻下分別給藥，每處病損一個位點注射0.1 mL相應試劑。曲安奈德濃度為0.1 mL∶2 mg,空白對照組不做處理。

1.4 體重、進食量、進水量記錄

每天記錄兔子的體重及進食量、進水量。

1.5 口腔潰瘍面積大小測定

建模成功后，每天拍攝口內潰瘍照片，以牙周探針矯正長度，用Image J軟件計算潰瘍面積大小。

1.6 取材

4 組兔子于給藥后的第3、6、9、12天各處死3 只兔子，取材。

1.7 HE染色

組織塊水洗后，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸蠟、包埋，切片，蘇木精染色。顯微鏡下觀察、評分，評分標準參照化學灼燒法建立動物潰瘍模評估藥物療效的Karavana等[7]學者的病理評分標準(表1)。

表1 評分標準Tab 1 Evaluation criterion

1.8 數據統計與分析

2 結 果

2.1 建模后進食量及體重變化

各組間兔子平均每天體重增量i-PRF組>TA組>BC組>NS組。且i-PRF組及TA組相較于NS組及BC組的體重增量差異有統計學意義。說明對潰瘍的不同處理方式中，i-PRF組及TA組對兔子日常生活的影響更小，恢復更快，因此體重增加較另外兩組快(圖1)。

圖1 各組兔子建模后平均每天進食量及體重增量

2.2 潰瘍面積變化結果

建模后第1天，目標區域可見表皮組織壞死，邊界清晰，周圍組織紅腫。給藥后3 d，可見病損面減小，表皮壞死面減小。給藥后第6天可見病損面積明顯減小，仍可見邊界紅腫。給藥后第9天病損區域黏膜部分愈合，無紅腫(圖2)。

圖2 潰瘍變化

建模24 h后各組所形成的潰瘍面積大小差異無統計學意義。由圖3可知，在給藥后第3、6天里均i-PRF組愈合最快，愈合效果與TA組相同。

圖3 各時間段各組潰瘍面積對比

2.3 HE染色結果

術后第3天,4 組均可見表皮壞死，膠原纖維水腫，可見炎性細胞，無新生血管。NS組膠原纖維松散紊亂。術后第6天，i-PRF組壞死組織脫落，成纖維細胞密集，可見明顯新生毛細血管，炎癥細胞較3天時減少。TA組及NS水組仍可見壞死組織，膠原纖維水腫。BC組炎癥細胞較其他3組密集。術后第9天，i-PRF組上皮形成，新生血管增多。TA組及NS組膠原纖維水腫，對照組無壞死組織，炎癥細胞較多。術后第12天，i-PRF組及TA組部分上皮形成完成，NS組、BC組上皮未完全愈合，TA組可見纖維玻璃樣變(圖4)。

圖4 各組樣本HE染色(×400)

圖5顯示：術后各組病理評分有差異，但差異沒有統計學意義(P>0.05)。其中i-PRF組隨時間的推移病理評分提高最快，TA組愈合速度較理想但組織預后結果不理想。

圖5 各時間段各組病理評分折線圖

3 討 論

口腔黏膜病中，發病率最高的為口腔潰瘍，口腔潰瘍的病因與諸多因素相關，目前仍病因不明[8]，因此沒有根治方法。但長期不愈的潰瘍嚴重影響患者生活，以臨床治療為出發點，設計了本實驗以探索一種安全有效的治療潰瘍病損的方式。

目前建立口腔潰瘍動物模型主要有物理法、生物學法及化學法。其中物理法主要包括機械創傷法及放射法建模，分別用于創傷性潰瘍的研究和放射性潰瘍的研究。生物學法建模中最常用的方法為：自身免疫抗原法，這是構建口腔潰瘍動物模型常用方法之一，此方法需先制備抗原佐劑，每兩周皮內注射抗原佐劑一次，重復5 周可建模成功。其優點是，建模原理與RAU的發病機制相似，其缺點亦顯而易見：(1)建模成功率不高；(2)自身免疫抗原法建模后潰瘍發生部位不定，愈合時間各異[9]，不利于實驗結果觀察。因此本實驗選用的建模方法是化學燒灼法，Cavalcante等[10]學者研究證實，該模型在病理特征和瘢痕形成機制上與人類創傷性潰瘍相似，同樣是研究口腔潰瘍常用動物模型之一。其優點是：操作方法簡單易行，建模成功率高，適用于大規模動物建模，可用于促潰瘍愈合藥物的臨床研究。缺點是：(1)不能完全模擬口腔潰瘍的發病機制；(2)化學藥物腐蝕性較強，實驗過程中藥物易外溢，造成大面積潰瘍。因此本實驗建模過程中使用固定大小的濾紙片10 片浸透在150 μL的50%冰醋酸中，使藥物不至于過多溢出，以固定藥物的用量。

口腔糜爛/潰瘍的治療方法種類繁多，目前主要治療目的為了加速創面愈合、緩解創面疼痛。其中最常用及療效顯著的方法為糖皮質激素的局部應用，曲安奈德注射液是最常用的糖皮質激素[11]。因此本實驗將i-PRF與曲安奈德對潰瘍的治療效果做對比，以觀察i-PRF是否有效。實驗結果表明，i-PRF及曲安奈德對促進潰瘍愈合的作用是相差無幾的，甚至i-PRF促進潰瘍愈合的病理評分優于曲安奈德。研究表明，反復注射曲安奈德可引起局部組織萎縮、變硬，局部抵抗力下降，易合并真菌細菌感染等并發癥[11]，本實驗也發現曲安奈德溶液易沉積于組織中，且曲安奈德組潰瘍病損處的HE染色切片可觀察到組織的玻璃樣變，其組織病理評分較i-PRF組低。而i-PRF有優良的促進病損愈合的作用，其原因與潰瘍組織的病理變化相關，組織學上，潰瘍由兩個主要結構組成：一個明顯的潰瘍邊緣區域，以及潰瘍底部的肉芽組織-結締組織成分。潰瘍邊緣區域表達表皮生長因子受體(EGF-R)，并活躍地增殖[12]，i-PRF中含有大量的EGF并且可以持續釋放2周[3]，EGF可通過誘導局部組織表達其受體從而促進口腔黏膜潰瘍愈合[13]，這與唾液中高含量的EGF以促進口腔黏膜快速更替有異曲同工之妙，且i-PRF中的EGF含量遠高于唾液；潰瘍底部的肉芽組織-結締組織成分是潰瘍愈合過程中的重要組成部分，因為它提供結締組織細胞，更重要的是提供修復潰瘍瘢痕內微血管所必需的微血管[14]。而i-PRF重要的特點除了含有大量的VEGF以促進毛細血管新生，更是有相對穩定的纖維蛋白基質，更有利于組織愈合。本實驗結果同樣顯示i-PRF組相較于有同樣刺激的生理鹽水組組織愈合更快，這與Crisci等[15]學者的研究結果相吻合，他們應用i-PRF治療了3 例糖尿病足伴骨髓炎患者，均取得了較好的治療效果，且觀察了術后2年，無不良反應及復發現象。

總而言之，目前治療潰瘍病損主要是通過阻止炎癥介質發生反應，降低自身免疫反應以阻止病損發展；另外通過促進細胞增殖、分化以促進病損愈合。而此文所研究的i-PRF中包含大量的細胞因子，既有抗炎作用，也可以促進細胞遷移，增殖，促進毛細血管新生[16-17]，因此i-PRF有促進潰瘍病損愈合的基礎條件。有學者將PRF以外敷的形式，用于治療口腔潰瘍[18]，結果表明PRF可促進潰瘍愈合。但口腔環境濕潤，凝膠置于病損處難以保持，因此本實驗選擇了液態形式的i-PRF黏膜下注射于病損組織內，有利于其更好的在病損處發揮作用。目前局部封閉治療仍為重型口瘡重要的治療方式。因此本實驗結果或可為臨床應用提供參考，但其發揮作用的機制有待進一步研究。