EphrinB2對TNF-α作用下的臍靜脈內皮細胞與牙髓干細胞血管生成的影響

黃雨亭 沈帥 蔣鵬飛 潘爽

中圖分類號:R329.2 文獻標志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.009

齲病、外傷、磨損等所引起的牙髓炎和根尖周炎是口腔常見疾病，目前臨床上主要的治療方法為根管治療。但是，這種治療無法恢復牙齒活力，牙齒因缺少牙髓組織的營養供應而變脆，從而增加劈裂的風險[1-2]。近年來，隨著組織工程技術的發展，利用組織工程原理再生牙髓組織是治療牙髓病及根尖周病理想的方法之一，其中血管再生是維持牙髓樣組織長期穩定的關鍵，對維護牙齒的生理機能具有重要意義[3-4]。有文獻報道血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族和eph家族都在血管形成過程中發揮較大作用。eph-ephrin信號通路包括ephs及其相應的配體ephrins，其中膜結合蛋白EphrinB2配體和ephb4受體被特異性地認為是血管發生中的關鍵調節劑[5]，EphrinB2可以穩定小管樣結構的形成[6]。有研究表明hDPSCs與HUVECs直接共培養時，hDPSCs中EphrinB2或者ephb4的敲除顯著抑制內皮發芽，導致毛細血管發芽減少[7]；另外有研究表明HUVECs與過表達EphrinB2的根尖乳頭干細胞共同培養可加速血管生成，產生灌注量更大的血管[8]。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是炎癥發生的早期標志因子，可以激活并調控多種細胞內信號通路，低劑量的TNF-α可誘導體內和體外血管生成[9]。本課題組前期研究表明TNF-α可促進共培養體系體外血管生成能力，Western blot證明實驗組較對照組VEGF表達顯著較高[10]，但EphrinB2是否在這一過程中發揮作用尚不明確。因此，本實驗目的是探究EphrinB2對TNF-α作用下的HUVECs與hDPSCs體外共培養系統中血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

DMEM高糖培養基(Hyclone，USA)；胎牛血清、青霉素/鏈霉素(雙抗)、0.25%胰酶/EDTA(Gibco，USA)；ECM培養基(Scien Cell,USA)；BCA試劑盒(武漢博士德)；EphrinB2、ephb4一抗(Abcam,USA)；7500 熒光定量PCR儀(ABI，USA)；凝膠圖像分析儀(UVP,USA)；PMC-860低速離心機(TOMY,日本)等。

1.2 hDPSCs的分離和培養、HUVECs的培養

經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審核通過[批號：2019JS16(研201935)]并經患者知情同意，在臨床上收集16～25 歲成人因正畸拔除的健康前磨牙或第三恒磨牙。無菌條件下取出牙髓，采用酶消化法分離培養hDPSCs[11-12]，傳代培養至第2代。本實驗所用HUVECs(CRL-1730)購自美國ATCC細胞庫。2～4代的hDPSCs 、HUVECs用于后續實驗。

1.3 Western blot檢測不同濃度TNF-α對共培養細胞EphrinB2表達的影響

胰酶分別消化hDPSCs和HUVECs，用混合培養液(ECM∶DPSCM=1∶1)重懸細胞，將其調整為3×105個/孔的單細胞懸液，將各組細胞混勻后輕輕接種在6 孔板中，待細胞完全貼壁后，隨機分別用TNF-α(0～80 ng/mL)處理9 h，加入裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白。BCA 法進行蛋白濃度測定。用10%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯氨酸凝膠電泳后,采用濕轉法轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，孵育一抗EphrinB2(1∶500)，β-actin(1∶1 000),置于4 ℃冰箱過夜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔多克隆二抗體,室溫孵育1 h，使用ECL發光試劑盒顯影，獲得圖像后采用Image J軟件進行灰度值分析，β-actin為內參。

1.4 沉默實驗

1.4.1 慢病毒感染hDPSCs細胞 胰酶消化hDPSCs以2×105個/孔接種于6 孔板中，常規條件下培養24 h，約30%～50%細胞融合時，采用特異性沉默EphrinB2的慢病毒(蘇州賽業生物)轉導hDPSCs，實驗設置3 個靶點以及空白對照組(Blank)與空載體對照組(Control)5 組，分別以數字標記靶點，分別是靶點1192，靶點1193，靶點1194。轉導hDPSCs 6～12 h，直至細胞出現毒性反應，除去慢病毒培養基并用新鮮的培養基代替終止轉染。加入1 μg/mL嘌呤霉素用于選擇穩定轉導的hDPSCs，直到可見耐藥菌落，使用熒光顯微鏡觀察轉導組熒光表達情況，培養至72 h提取蛋白，轉導結束后，Western blot檢測轉導沉默效率，方法如前述。

1.4.2 體外小管形成實驗 20 ng/mL的TNF-α被用于下述實驗，實驗分為：TNF-α+HUVECs +hDPSCs，HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs，TNF-α+HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs 3 組。實驗前一天，將Matrigel膠(BD Biosciences,美國)置于4 ℃冰箱備用。于預冷的96 孔板中，每孔加入60 μL Matrigel膠(緩慢加入，避免氣泡產生)，37 ℃孵箱內放置1 h。胰酶分別消化hDPSCs/病毒轉導的hDPSCs、HUVECs，用混合培養液(ECM∶DPSCM=1∶1)重懸將其調整為1.5×104個/mL的單細胞懸液，將各組細胞混勻后輕輕接種在預先涂有Matrigel膠的96孔板中，同時給予不同濃度(0，20 ng/mL)的TNF-α處理，37 ℃孵育，于第12小時鏡下觀察小管形成形成情況并拍照記錄，使用Image J軟件測量比較各組隨機5 個視野中小管形成的相對長度和分支點數目。

1.4.3 Western blot檢測各組EphrinB2的表達 實驗分為：TNF-α+HUVECs+hDPSCs，HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs，TNF-α+HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs 3 組，胰酶消化細胞，用混合培養液(ECM∶DPSCM=1∶1)重懸將其調整為2×105個/孔的單細胞懸液接種于6孔板中，同時給予不同濃度(0、20 ng/mL)的TNF-α處理，37 ℃孵育，于第9小時提取細胞總蛋白，Western blot檢測EphrinB2的表達，方法同前。

1.5 統計學分析

數據采用 GrapPad prism 7軟件進行獨立樣本T檢驗和單因素方差分析。所有實驗獨立重復3 次，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度的TNF-α對EphrinB2表達的影響

共培養體系加入不同濃度(0～80 ng/mL)的TNF-α，Western blot檢測EphrinB2的蛋白表達水平發現在加入20 ng/mL的TNF-α共培養組，EphrinB2蛋白表達水平較空白對照組顯著上調(P<0.001)(圖1)。

圖1 不同濃度的TNF-α作用下EphrinB2表達水平

2.2 慢病毒轉導hDPSCs及轉導結果

2.2.1 hDPSCs轉導沉默EphrinB2基因的慢病毒載體 熒光顯微鏡觀察到增強綠色熒光標記的靶點1194轉導后的hDPSCs；Western blot結果顯示靶點1194組hDPSCs中EphrinB2的表達受到明顯抑制(P<0.000 1)(圖2)。

圖2 慢病毒載體包裹的EphrinB2轉導牙髓干細胞

2.2.2 體外小管形成實驗 通過比較小管相對長度、分支點數進行實驗分析。小管形成實驗結果中灰色圖像為普通圖像，增強的綠色熒光圖像代表shRNA轉導后的hDPSCs，熒光未顯影組代表未用shRNA處理hDPSCs組。結果顯示，共培養第12小時，HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs組小管已經塌陷裂解，與HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs組相比，TNF-α+HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs組小管的相對長度較長，相對分支點較多。與TNF-α+HUVECs+hDPSCs組相比，HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs組和TNF-α+HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs組小管的相對較短(圖3)。

2.2.3 Western blot 檢測各組EphrinB2的蛋白表達結果 與TNF-α+HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs組和HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs組相比，TNF-α+HUVECs+hDPSCs組 EphrinB2、ephb4的蛋白表達較高。與HUVECs+EphrinB2-shRNA-hDPSCs組相比，TNF-α+HUVECs+EphrinB2-shRNA- hDPSCs組的EphrinB2和ephb4蛋白的表達較高(圖4)。

圖4 Western blot分析EphrinB2、ephb4的蛋白表達結果

3 討 論

組織工程技術是一種相對較新的多學科方法，旨在利用細胞、支架和生長因子的組合來再生受損、患病或喪失的組織，并恢復或改善其功能。牙髓含有血管、神經和結締組織，對牙齒起到營養、修復等作用[13]。目前，利用組織工程的方法再生牙髓組織能夠克服傳統根管治療帶來的折裂的風險，有望降低牙齒缺失的發生率[13-14]。

有研究表明hDPSCs與HUVECs共培養可促進血管形成[15-16]，hDPSCs具有較強的增殖能力、自我更新能力及多向分化潛能[17]，hDPSCs釋放的營養因子能夠提高HUVECs的存活和分化，從而觸發明顯的血管生成[18]。而局部微血管網絡的快速生成是牙髓組織再生成功的關鍵，可以給細胞提供足夠的氧氣和營養[16-17，19]。

T： TNF-α 20 ng/mL； H： HUVECs； D： hDPSCs； shD: EphrinB2-shRNA-hDPSCs

低劑量的TNF-α可誘導體內、體外血管生成[9]，該途徑通過旁分泌和/或自分泌機制調控[20],并受到各種血管生成因子的影響。本課題組前期實驗表明在HUVECs與hDPSCs共培養體系中加入TNF-α可促進 HUVECs和hDPSCs共培養系統形成更廣泛、穩定的血管樣網格結構,并且延長了這些小管結構的分解時間和VEGF蛋白的表達。

因本實驗主要研究血管穩定性，通過Western blot灰度分析適宜EphrinB2的TNF-α的最佳濃度，發現20 ng/mL的TNF-α與空白對照組相比更能促進EphrinB2的表達(圖1)。因此，20 ng/mL的TNF-α被用于后續實驗，隨后用特異性沉默EphrinB2基因的慢病毒小發夾RNA(shRNA)轉導hDPSCs后，通過熒光顯微鏡觀察增強的綠色熒光代表的沉默圖像，通過Western blot檢測轉導效率，靶點1194與空白對照組相比EphrinB2表達顯著降低，表明病毒轉導成功(圖2)。血管樣網格結構的形成與穩定性實驗和蛋白免疫印跡分析結果表明，加入TNF-α組的hDPSCs未沉默組較組加入TNF-α的hDPSCs沉默組小管更穩定且完整，加入TNF-α的hDPSCs沉默組又較不加TNF-α的hDPSCs沉默組小管穩定且完整，EphrinB2和ephb4表達也較高(圖3)。

綜合以上研究，顯示低濃度的TNF-α(20 ng/mL)可以通過激活EphrinB2/ephb4通路逆轉共培養體系沉默hDPSCs的EphrinB2引起的小管的裂解，從而促進小管的形成與穩定，但是如何在體內應用 TNF-α促進牙髓再生中的血運重建,仍需要進一步探索。