NCOA7在缺氧條件下通過AhR調控OSCC細胞糖酵解過程

羅笛 謝小燕 尹曉敏 程秀鳳 張妮 候雅 高義軍

中圖分類號:R739.8 文獻標志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.014

據統計口腔鱗癌患者5年生存率約為50%[1]，且半數患者在初次治療后出現復發或轉移[2]。低氧環境下的糖酵解途徑加強有助于促進口腔鱗癌的遷移和侵襲[3-4]。而核受體輔激活蛋白7(nuclear receptor coactivator 7，NCOA7)是近年發現在口腔癌發生發展中可能有重要作用的因子，可作為芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)的核共激活因子發揮其作用[5]。研究表明激活AhR可在缺氧條件下明顯抑制CD4+T細胞糖酵解效應，而在常氧條件下未產生這些作用[6]。這為研究低氧環境下口腔鱗癌的進展提供了研究思路。

本研究在體外構建了口腔鱗癌細胞株的缺氧模型，并確定了缺氧條件下NCOA7和AhR在口腔癌細胞株中的表達變化及對糖酵解效應的調控作用，深入了解低氧環境下口腔鱗癌發生發展的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗標本 收集2019 年07月～2019 年08 月在中南大學湘雅二醫院收治的口腔鱗癌患者5 例，分別取每位患者舌部的OSCC組織和OSCC癌旁組織(約癌旁3 cm處)標本，固定包埋，切片。本項研究已通過中南大學湘雅二醫院倫理委員會批準[批準號：(2019)倫審第(研138)]，并取得患者書面知情同意。

1.1.2 實驗試劑 氯化鈷(CoCl2·6H2O)(Sigma公司，美國)；豆蔻素(Cardamonin)(MedChemExpress，美國)；葡萄糖測定試劑盒和乳酸測定試劑盒(南京建成公司)；CCK8試劑盒(Dojindo公司，日本)；兔抗人NCOA7多克隆抗體(Abcam公司，英國)；鼠抗人AhR單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)；鼠抗人HIF1α多克隆抗體(Affinity Biosciences，美國)；鼠抗人β-actin多克隆抗體、兔，鼠二抗(Proteintech公司，美國)；jetPRIME?轉染試劑盒(jetPRIME?公司，瑞士)；SYBR Green qRCR 試劑盒(TaKaRa公司，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫熒光雙重染色 將標本切片用二甲苯脫蠟，水化。PBS沖洗后，抗原修復-高壓熱修復，沖洗，非免疫正常山羊血清封閉切片60 min。一抗為NCOA7(1∶200)和AhR(1∶200)，4 ℃孵育過夜。熒光二抗在室溫下避光孵育30 min，DAPI復染3 min，沖洗，封片。滴加適量抗熒光淬滅封片液后進行顯微鏡檢查。

1.2.2 細胞培養 人舌鱗癌細胞(SCC9)由中南大學湘雅二醫院口腔醫學研究中心龔朝建教授惠贈。DMEM/F12細胞培養基和10%胎牛血清，添加400 ng/mL氫化可的松培養， 5%CO2，37 ℃。

1.2.3 SCC9細胞缺氧模型的構建 無菌超純水溶解CoCl2·6H2O至0.1 mol/L，使用時用DMEM/F12細胞培養液稀釋，工作液濃度為0～800 μmol/L。CCK8實驗用于檢測細胞活力。取對數生長期的細胞種入96 孔板，37 ℃孵育，待其生長至亞單層后，每孔更換含不同濃度CoCl2的培養基100 μL，設置不加CoCl2的陰性對照組及無細胞的空白對照組，每組設6 個復孔，干預24 h。檢測時，加入10 μL CCK8溶液/孔，37 ℃孵育，每半小時檢測450 nm波長光下各孔的吸光度值(A值)，各組A值均為1～2 h計算細胞存活率及半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)。細胞存活率(%)=(加藥組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。同時用WB方法檢測細胞中缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α)的表達情況以確認缺氧模型誘導成功[7]。

1.2.4 逆轉錄聚合酶鏈反應 用TRIzol試劑從SCC9細胞中提取總RNA，反轉錄成互補cDNA。取1 μg cDNA，使用SYBR Green Master Mix一步法進行擴增。在LightCycler?96儀器上將反應混合物加熱至95 ℃持續30 s，將95 ℃持續5 s；60 ℃持續31 s進行40 個循環，后加熱至97 ℃持續1 s，以GAPDH為內參。

1.2.5 蛋白質印跡 從SCC9細胞中提取總蛋白。8%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，每個泳道25 μg總蛋白。分離后將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶溶于TBST溶液用于封閉，室溫下封閉60 min。修剪條帶，一抗NCOA7(1∶1 000)，HIF1α(1∶500)和AhR(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。充分洗滌(TBS-T溶液，4×15 min)后，室溫下二抗(1∶1 000)孵育1 h。通過化學發光檢測將蛋白質條帶可視化。以β-actin(1∶1 000)為內參。

1.2.6 細胞轉染 按照jetPRIME?siRNA轉染試劑說明書中的方案進行轉染。轉染細胞在5%CO2，37 ℃孵育。正常細胞和轉染無義siRNA(siRNA-NC)細胞為對照。

1.2.7 葡萄糖消耗及乳酸生成測定 按照葡萄糖測定試劑盒和乳酸測定試劑盒說明書，以比色法測定培養上清液中的葡萄糖和乳酸含量(檢測波長為505 nm)，同時使用CCK8實驗檢測細胞增殖情況，排除由于細胞數目不均產生的干擾。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 NCOA7和AhR在口腔鱗癌組織中表達

NCOA7(67.66±5.19: 25.94±2.18，t=18.150，P<0.000 1)和AhR(35.02±1.72: 24.94±3.31，t=6.627，P<0.000 1)在口腔鱗癌組織中平均熒光強度高于癌旁組織，即在癌組織中高表達(圖1)。

圖1 NCOA7及AhR在口腔鱗癌組織及癌旁組織中的表達情況

2.2 氯化鈷誘導細胞缺氧模型的構建

隨著CoCl2干預濃度升高SCC9細胞出現生長抑制，EC50為386.4 μmol/L(圖2A)，而HIF1α表達逐步增加(圖2B、2C，P<0.01)。故細胞缺氧誘導成功，選350 μmol/L為中心處理濃度。

圖2 氯化鈷誘導OSCC細胞缺氧模型的構建

2.3 缺氧條件下AhR和NCOA7的表達情況

以是否CoCl2干預為常氧組和缺氧組，發現缺氧條件下AhR蛋白表達(圖3A、3B，P=0.031 2<0.05,t=3.255)和mRNA表達(圖3C，P=0.033 2<0.05,t=3.190)均出現下降，而NCOA7的表達不受影響(圖3D～3F)。

2.4 缺氧條件下沉默NCOA7對AhR表達的影響

綜合不同濃度siNCOA7的轉染效率(圖4A)及沉默效率(圖4B)，選用30 nmol/L為處理濃度。沉默NCOA7后發現AhR蛋白表達(圖4C，常氧：P=0.000 9<0.001,t=8.790; 缺氧:P=0.001 9<0.01,t=7.270)和mRNA表達(圖4D，常氧：P=0.008 6<0.01,t=4.810; 缺氧:P=0.004 2<0.01,t=5.887)均降低，且缺氧時沉默NCOA7對AhR的蛋白表達抑制率從34.1%升至40.7%(P=0.002 6<0.01,t=6.656)，mRNA抑制率從37%升至89.5%(P=0.003 4<0.01,t=6.212)。

A～B： 常氧及缺氧條件下AhR蛋白的差異表達； C： AhR mRNA的表達差異； D～E： 常氧及缺氧條件下NCOA7蛋白的差異表達； F： NCOA7 mRNA的表達差異

A：siNCOA7(紅色熒光標記)轉染效率； B：siNCOA7沉默效率； C：常氧及缺氧條件下沉默NCOA7后，NCOA7及AhR的蛋白表達差異； D：常氧及缺氧條件下沉默NCOA7后，NCOA7及AhR的mRNA表達差異

2.5 缺氧條件下NCOA7及AhR對口腔鱗癌細胞糖酵解的調節

圖5示缺氧條件下NCOA7沉默細胞糖酵解水平增強(葡萄糖消耗：P=0.017 8<0.05,t=3.883;乳酸生成:P=0.007 0<0.01,t=5.089)。而常氧條件下，無論NCOA7沉默與否細胞糖酵解水平無明顯變化。NCOA7沉默細胞用豆蔻素(Cardamonin，AhR激活劑[8]，濃度30 μmol/L)干預后，發現缺氧條件下豆蔻素可使沉默NCOA7增強的糖酵解水平回落(葡萄糖消耗：P=0.005 6<0.01,t=5.433; 乳酸生成:P=0.028 7<0.05,t=3.344)。

圖5 缺氧條件下NCOA7及AhR對SCC9細胞糖酵解水平的調節作用

3 討 論

核受體輔激活蛋白7，抗氧化基因OXR家族的一員[9]。芳香烴受體AhR，一種可被多種外源和內源性配體激活的轉錄因子[10]。AhR受環境中多環芳烴激活后轉移到細胞核中與AhR核轉運蛋白(ARNT)及其他幾種核受體共激活劑(包括NCOA7)形成復合物，這種復合物與癌癥的發生有關[11]。本研究發現NCOA7和AhR同時在口腔鱗癌組織細胞核中高表達，佐證了NCOA7是在細胞核與AhR結合而發揮其作用。缺氧環境下AhR表達下降，而NCOA7表達無明顯變化。這可能是由于缺氧條件下，HIF1α-ARNT(HIF1α和AhR的共同輔因子)異二聚體的豐度和活性增加抑制了AhR的表達[12]。高效率沉默NCOA7表達后AhR表達下降證明了NCOA7對AhR的正向調控作用。一項有趣的發現是缺氧條件可加強沉默NCOA7對AhR的抑制作用。

糖酵解增強是快速進展型癌癥的微環境特征之一[13]。Lv等[6]發現，激活AhR在缺氧條件下可明顯抑制CD4+T細胞的糖酵解效應，而常氧下并無調控作用，為研究鱗癌缺氧條件下的糖酵解效應提供了思路。本研究沉默NCOA7后發現同樣僅在缺氧條件下癌細胞的糖酵解水平才有所增加。進而為驗證AhR是否參與NCOA7對糖酵解的調節作用，本研究使用AhR激活劑(豆蔻素[8])進行干預，發現豆蔻素可使沉默NCOA7增強的糖酵解水平回落。由此缺氧條件下NCOA7可通過AhR干預口腔鱗癌細胞的糖酵解水平。

口腔鱗癌進展過程中缺氧環境可顯著增加HIF1α水平，并通過螯合ARNT激活糖酵解效應[12]。而AhR同樣受多環芳烴刺激而升高，在細胞核內競爭與ARNT的結合并吸附NCOA7[11]。本研究發現在缺氧條件下NCOA7可通過AhR干預口腔鱗癌的糖酵解水平。這為靶向NCOA7的藥物治療提供了新思路和實驗基礎。