顯微化學去齲技術臨床及生物學研究

張富華 管理霞 余曉沁

中圖分類號:R781.1 文獻標志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.021

臨床上治療齲病常規使用高速渦輪機和慢速手機的機械方法完全去除患牙的齲壞組織，然后進行牙齒修復；該方法雖然快速簡便易行，但是治療過程中患者會產生酸痛敏感癥狀，而且在處理深部病變時，這種技術會增加患牙牙髓暴露的風險。為減少創傷和提高治療過程中的舒適程度，學者們提出了微創牙科治療(minmum-intervention dentistry)[1]的理念。在齲病治療領域中,微創治療要求以最小的牙體創傷去凈齲損組織,最大程度地減少患者痛苦,降低牙髓暴露發展成牙髓炎的風險。

化學去齲方法是首先用能溶解齲損組織的化學藥物軟化齲損牙體組織,然后再以手用器械將壞死組織完全清理干凈[2]。目前,常用的化學去齲系統為 Carisolv系統 , 又稱伢典，由Carisolv凝膠和 Carisolv手用工具組成。化學去齲基于微創治療的理念,已經證明可以去除污染較嚴重的齲壞牙本質，同時保留脫礦的受影響的牙本質[3]。如果結合使用手術顯微鏡,用來增強術區的光照與放大,從而保證齲洞預備及充填的質量。本研究擬通過比較顯微化學去腐技術和傳統渦輪機技術去齲過程中患者對疼痛的反應和1年后患牙的預后來評價去齲技術的臨床應用情況；同時通過生物學技術比較不同去齲技術去齲效果的差異。

1 材料與方法

1.1 材料和器械

Carisolv Ⅲ凝膠、特制手工工具(MediTeam Dental AB 公司，瑞典)；蓋髓材料iRoot BP Plus(Innovative Bioceramix公司，加拿大)；充填材料用玻璃離子水門汀(松風公司，日本)；自酸蝕粘接劑、3M FiltekTMZ350XT通用型納米樹脂(3M公司，美國)；牙科手術顯微鏡(ZeissPico，德國)；橡皮障(康特公司，瑞士)。

1.2 實驗分組的方法

選取2018 年01 月～2019 年08 月至合肥市口腔醫院牙體牙髓二科就診的患者60 名，60 例患牙，使用隨機數表方法將患者隨機分為實驗組和對照組，每組30 名。2 組患者一般資料比較差異無顯著性。該研究得到合肥市口腔醫院倫理委員會批準(批號： Y20180107)，在患者知情并簽署知情同意書的情況下進行。

納入標準：(1)患者年齡在18 歲以上的男性或女性，總體健康狀況良好；(2)在根尖片射線照片中，至少可以發現1個深度齲齒病變；X線片上顯示齲損至牙本質深層；(3)無牙髓炎癥狀；(4)術前根尖片中根尖無透射性影像；(5)第一或者第二磨牙。

排除標準：(1) 不可逆性牙髓炎的臨床癥狀或者牙髓炎疼痛病史；(2)瘺管或腫脹的存在；(3)外部或內部牙根吸收；(4)牙齒松動或者有叩診疼痛；(5)孕婦。

操作前所有患牙均要拍攝根尖片，評估根尖周組織是否正常。使用溫度測試和牙髓電測試的方法評估患牙牙髓狀態。由兩名高年資牙髓病專業醫生共同評估，形成共識。

實驗組：顯微鏡下伢典化學去齲技術手工去齲。患牙上橡皮障，暴露目標牙齒，調節顯微鏡，聚焦至齲壞處(2.5 倍)。使用高速裂鉆打開去腐通路，去除無基釉至釉牙本質界后，將Carisolv透明凝膠狀注入齲洞內，注滿為止，靜置30 s，Carisolv配套的特制手持器械在齲洞壁上輕輕摩擦，至凝膠渾濁，用滅菌水沖洗干凈，重新注入清潔的凝膠，如此反復，至注入的凝膠不再渾濁，直至顯微鏡下觀察均為健康牙體組織。

對照組：常規渦輪機技術機械去齲。在橡皮障下，高速球鉆配合慢速球鉆去除腐質，至肉眼下無明顯齲壞組織，并用手持器械輕輕摩擦洞壁時感到洞壁堅硬，說明齲已去盡。

去腐標準:按照國際齲病共識協作組(international caries consensus collaboration，ICCC)推薦，對于本次研究對象的患牙去腐使用選擇性去齲(selective removal)標準。 進行選擇性去齲時，窩洞側壁和髓壁去齲標準不同。為獲得最佳的粘接封閉性，窩洞邊緣應為健康的牙釉質，窩洞側壁應為硬化牙本質，即與健康牙本質有類似的觸感，用探針或手用挖匙劃過牙本質表面時有刮擦音。為避免牙髓暴露，窩洞髓壁可保留軟化牙本質。

實驗組和對照組的患牙去齲后均使用iRoot BP Plus覆蓋軟化牙本質，然后玻璃離子墊底，納米樹脂分層充填。實驗組及對照組臨床操作均由同一名操作者完成，由配合護士記錄臨床觀測指標。

1.3 臨床觀測指標

使用疼痛視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS)方法[4]進行疼痛分級。使用0～10標度記錄術中疼痛程度，患者根據主觀感受評價疼痛：0為無痛，1～3為輕度疼痛，4～6為中度疼痛，7～10為重度疼痛。

12 個月后對每顆納入研究的患牙進行評價其治療的成功或者失敗。患牙維持對溫度和電測試的正常反應，沒有自發性疼痛，沒有叩診壓痛，沒有竇道或腫脹，并且根尖片上不存在透視性影像則被評價為成功。反之，則評定為失敗。

去齲前后牙體組織中變形鏈球菌活菌數量的變化。通過樣本qPCR臨界循環數(cycle threshold, Ct)數值表示活菌的濃度。

1.4 樣本DNA提取與定量聚合酶鏈反應

實驗組和對照組去齲完成前后，分別使用無菌挖勺收集患牙軟化牙本質并稱重。

按照李聰聰等[5]的方法制備PMA儲備液并進行疊氮溴化丙錠(PMA)處理樣本。將所有樣本利用細菌基因組DNA快速提取試劑盒(ATP Genomic DNA Mini Kit?; ATP Biotech, Taipei,Taiwan)提取基因組DNA，作為熒光定量PCR的反應模板。操作按照生產廠家說明書進行。

采用Taqman?探針(賽默飛，美國)，qPCR 方法定量檢測變形鏈球菌[6]。 每次定量PCR反應都設空白對照(以相同體積的雙蒸水取代 DNA)，每次測定設 2 個平行樣。

1.5 qPCR標準曲線的建立

將提取到的 DNA 標準品采用去離子水10 倍梯度稀釋，進行PCR反應，以標準品濃度的對數值為橫坐標，以 Ct數值為縱坐標建立qPCR的標準曲線(圖1)。

圖1 qPCR的標準曲線

通過標準曲線計算:(1)樣本中目標細菌細胞總數：不加PMA使用qPCR獲得；(2)樣本中目標細菌生活細胞數：使用PMA-qPCR獲得；(3)樣本中目標細菌死亡細胞數：qPCR-(qPCR-PMA)。

1.6 統計學分析

根據卡方檢驗的結果比較2 組間患牙治療的成功率；根據T檢驗結果分析兩組病例術后VAS自評分值的差異；使用獨立樣本T檢驗來比較每組中不同去腐方法齲腐前后的生活細菌組織濃度的改變和組間生活細菌組織濃度的變化。

2 結 果

2.1 牙齒治療成功率

1 年后隨訪,一共有7 顆牙齒失去隨訪(實驗組3 顆；對照組4 顆)；對照組和實驗組的成功率分別為71.4%(16 顆牙齒失敗)和91.2%(5 顆牙齒失敗)。差異具有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 牙齒治療成功率Tab 1 Success rate of caries treatment

2.2 患者VAS自評分值

T檢驗發現實驗組的分值高于對照組(P=0.000)(表2)。

表2 患者VAS自評分值Tab 2 VAS scales of pain of the subjects

2.3 去齲前后變形鏈球菌活菌濃度的變化

實驗組和對照組均發現挖掘后活菌濃度顯著降低(P<0.01)(表3)。2 種去齲技術在降低深部齲損病灶中細菌活菌濃度方面差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 去齲前后qPCR的Ct值Tab 3 Changes in CT value of qPCR after caries removal

3 討 論

本實驗比較了顯微化學去齲(實驗組)與常規渦輪機方法去齲(對照組)2 種去齲技術臨床效果和預后。使用實驗組方案處理的牙齒中預后比較好的原因可能與在去腐對牙髓造成的機械和熱刺激的減少有關[7-8]。研究表明使用Carisolv凝膠在沒有器械放大的情況下去除齲損組織，在1 年后使用CBCT時檢查，只有65.4%的患牙被認為是健康的，這一研究結果與對照組研究結果相似(73.3%)，但低于使用手術顯微鏡+Carisolv凝膠去腐的實驗組的成功率(91.2%)，提示術中使用手術顯微鏡，可以增強操作者的視野，則可能有助于避免術中不必要的組織損傷[9]。

在本研究中，與渦輪去腐技術相比，實驗組患者術中感到疼痛明顯較少。其他研究者也對Carisolv化學去齲法術中的患者的感受進行了研究，結果和本研究相似[1,10-11]。然而，Peric等[12]觀察到在他們的研究中，有很大比例的受試者在使用Carisolv去腐時方法報告疼痛，這種結果的差異變化可能是由于疼痛的主觀性質以及個體間疼痛閾值的變異性所致。機械渦輪去腐技術和化學去腐技術之間疼痛評分的差異可能因為后一種方法操作過程中沒有渦輪手機的聲音，減輕了患者的焦慮。同時化學凝膠本身可能具有隔熱作用，并覆蓋了牙本質小管，隔絕了操作過程中對牙髓的物理刺激。

雖然使用牙科鉆頭可以去除更多齲牙本質，從而去除更多細菌，然而Carisolv凝膠由于其自身具備的抗菌性和高pH值可降低細菌細胞活力(Azrak等，2004)[13]。本研究發現兩種去齲方法都可以將齲損處生活細菌組織濃度降低，但是實驗組的降低程度明顯高于對照組。但本研究的結果與之前Lager等[14]的結果研究不太一致，他們發現這兩種去齲技術在降低細菌組織濃度方面具有相同的效率; Ammari等[15]，研究結果的差異可能是因為之前的研究沒有考慮研究細菌的細胞活力，單獨使用定量PCR不能區分活細菌和死細菌，只能指示存在的細菌總量。判斷感染性疾病病灶中是否存在生活致病菌對于疾病的精確地診斷和治療有著更重要意義，因此本研究采用PMA結合定量PCR方法檢測深齲病損處生活變形鏈球菌的數量的變化，以此來判斷去齲技術的去腐效率可以更符合臨床實際情況，而且病損處生物標志物方面的檢測可能具有預測原位治療結果的潛力。PMA是一種光敏DNA結合染料,可以選擇性結合細胞死亡后“暴露”出的DNA，這樣定量PCR時就只擴增未結合PMA的生活細胞DNA，不擴增已結合PMA的死亡細胞DNA[16-18]。

本研究發現應用Carisolv凝膠結合手術顯微鏡的微創化學去腐方案更能保持患牙牙髓根尖周的健康，而且可以減少術中的疼痛不適，并能明顯降低齲損處活細菌濃度。