PD-1、PD-L1在口腔鱗狀細胞癌中表達意義及對疾病預后價值研究

田國永 鹿國英 呂志軍 付深利

中圖分類號:R739.8 文獻標志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.023

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一種具有侵襲性的上皮性腫瘤，其發生發展與多個基因表達異常有關，尋找有效的預后標志物對改善患者預后具有重要意義。程序性死亡分子1(programmed cell death 1，PD-1)是免疫抑制分子，可誘導程序性細胞死亡，程序性死亡受體-配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是PD-1配體之一，主要在惡性腫瘤組織中誘導表達，PD-1/PD-L1途徑可限制過度免疫反應，保護正常組織免受損傷[1]。發生腫瘤時，誘導PD-L1表達升高，激活PD-1/PD-L1途徑，促使腫瘤細胞逃避免疫系統殺傷，在體內存活增殖。已有研究顯示，PD-L1在胰腺導管腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常高表達，通過靶向阻斷PD-1/PD-L1通路，是促進抗腫瘤免疫應答的主要途徑之一[2-3]。目前，PD-L1、PD-L1在OSCC中研究較少，本研究分析PD-L1、PD-L1在OSCC組織中表達，旨在探討其對OSCC預后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015 年06 月～2018 年03 月期間，本院收治的OSCC患者93 例，其中男性52 例，女性41 例，年齡35～72 歲。納入標準：(1)首次確診為OSCC，術前未進行任何治療；(2)經頜面外科醫生評估，可予以手術切除；(3)術后病理學確診為OSCC；(4)接受手術及輔助放化療的綜合治療方案。排除標準：(1)合并自身免疫性疾??；(2)合并有口腔黏膜疾??；(3)合并有其他部位腫瘤；(4)住院期間死亡患者。本研究獲得所有患者及家屬同意，并經醫院倫理委員會批準。

1.2 HE染色及免疫組織化學染色

用10%中性甲醛固定腫瘤及癌旁組織，包埋、切片，脫蠟水化，常規HE染色，光鏡下觀察組織學變化。取切片，脫蠟水化，枸櫞酸鈉修復抗原，3%H2O2避光孵育10 min，PBS浸洗，加入山羊血清封閉液，加入PD-1單抗、PD-L1單抗4℃孵育過夜，復溫，PBS浸洗，加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗，DAB顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。結果判定[4]：采用雙盲法閱片，根據細胞染色強度評分，≤2 分為陰性(-)，>2 分為陽性(+)。

根據染色結果分析：(1)PD-1、PD-L1在癌旁組織和OSCC組織中的表達；(2)PD-1、PD-L1在OSCC組織中表達相關性；PD-1、PD-L1表達與臨床病例參數相關性；(3)PD-1、PD-L1對OSCC預后預測價值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 24.0統計分析，計數資料以(例，%)表示，組間比較采用χ2檢驗；生存率組間比較采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗，Spearman采用相關分析法分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色結果

HE染色結果顯示，癌旁組織黏膜上皮層次結構正常；OSCC組織細胞異型，呈核分裂像，鱗狀上皮增生，癌細胞呈條索狀或團塊狀侵入結締組織內(圖1)。

圖1 組織病理學檢查(HE， ×200)

2.2 PD-1、PD-L1在癌旁組織和OSCC組織中的表達

PD-1、PD-L1在OSCC組織中陽性表達率高于癌旁組織(P<0.05)(表1，圖2～3)。

表1 癌旁組織和OSCC組織PD-1、PD-L1表達[n(%)]Tab 1 PD-1 and PD-L1 expression in OSCC and adjacent tissues[n(%)]

圖2 PD-1在癌旁組織和OSCC組織中的表達(SP, ×400)

圖3 PD-L1在癌旁組織和OSCC組織中的表達(SP×400)

2.3 PD-1和PD-L1表達的相關性

PD-1和PD-L1在OSCC及癌旁組織中表達無相關性(P>0.05)(表2)。

表2 PD-1、PD-L1表達在OSCC及癌旁組織表達相關性分析[n(%)]Tab 2 Correlation analysis of PD-1 and PD-L1 expression in OSCC and adjacent tissues[n(%)]

2.4 PD-1、PD-L1表達與患者臨床病理參數的關系

低分化程度OSCC組織中PD-1陽性表達率高于高分化組織(P<0.05)；發生淋巴結轉移和III～IV期OSCC組織中PD-L1陽性表達率高于未發生淋巴結轉移及I～II期組織(P<0.05)(表3)。

2.5 PD-1、PD-L1表達對OSCC預后的影響

共82 例患者獲得隨訪。PD-1、PD-L1陰性表達患者生存率均高于陽性表達患者(P<0.05)(圖4)。

圖4 PD-1和PD-L1陽性表達與陰性表達OSCC患者總生存率比較

3 討 論

OSCC轉移和發展涉及多基因共同作用，其中免疫學腫瘤微環境與OSCC發生發展過程密切相關[5]。T淋巴細胞介導腫瘤細胞免疫應答，腫瘤微環境中T淋巴細胞功能障礙是導致腫瘤細胞免疫逃逸的關鍵。PD-1及其配體PD-L1是重要免疫檢查點，腫瘤細胞中PD-1與PD-L1結合，抑制T淋巴細胞免疫功能，促進腫瘤細胞免疫逃逸，與預后不良有關[6]。腫瘤微環境中免疫機制與OSCC關系密切，本研究通過檢測PD-1、PD-L1在OSCC中的表達及意義，以期為OSCC免疫治療提供實驗指導。

腫瘤組織中PD-1、PD-L1高表達與腫瘤微環境中T淋巴細胞活化有關，阻斷PD-1/PD-L1的免疫療法有望成為新的替代治療方法[7]。既往研究顯示，PD-1、PD-L1在小兒腦腫瘤以及非小細胞肺癌患者中陽性表達率均較高[8-9]。本研究采用免疫組化法對OSCC患者癌旁組織和腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達進行檢測，結果顯示，OSCC組織中PD-1、PD-L1陽性表達率明顯高于癌旁組織，提示PD-1、PD-L1與OSCC發生發展有關，高表達PD-1、PD-L1可能促進腫瘤進展，為OSCC進行免疫治療提供病理支持。另外，PD-1、PD-L1高表達還與腫瘤一些臨床特征密切相關，Cao等[10]研究顯示，結膜黑色素瘤患者可檢測到PD-1、PD-L1表達，且PD-L1表達與遠處轉移及患者生存期有關。Zhou等[11]研究發現，鼻咽癌患者PD-1、PD-L1表達升高，PD-L1高表達與rTNM分期、貧血狀態以及復發有關。郭曉宇等[12]報道，胃癌患者PD-1表達與浸潤深度有關，而PD-L1表達與患者年齡、腫瘤分化程度、直徑以及浸潤深度有關。本研究進一步對PD-1、PD-L1表達與患者年齡、性別、發病部位、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期的關系進行比較，結果顯示，低-中分化OSCC組織中PD-1陽性表達率高于高分化，發生淋巴結轉移和III～IV期OSCC組織中PD-L1陽性表達率高于淋巴結未發生轉移及I～II期，由此可知，PD-1、PD-L1不僅參與OSCC進展，并且兩者陽性表達率隨著OSCC惡性程度升高而增加，提示PD-1、PD-L1表達水平與OSCC患者病情程度有關。

PD-1、PD-L1作為腫瘤免疫逃逸中關鍵分子，在腫瘤中具有預后價值。Tan等[13]檢測164例卵巢癌患者外周血單核細胞中PD-1、PD-L1表達水平，表明PD-1、PD-L1多態性可增加卵巢癌風險，二者表達異常與預后不良關系密切。Wyss等[14]發現，原發性結腸癌和肝轉移瘤患者間質PD-1、PD-L1表達與患者腫瘤侵襲性生物學行為有關，可作為預后指標。在轉移性透明細胞性腎細胞癌患者中，PD-1、PD-L1表達與腫瘤惡性程度及T淋巴細胞浸潤相關，并可影響患者整體生存率[15]。本研究應用Kaplan-Meier生存曲線比較PD-1和PD-L1不同表達患者生存率，結果顯示，PD-1和PD-L1高表達患者術后生存時間較低表達患者明顯減少，提示PD-1、PD-L1與OSCC患者生存率有關，具有重要預后意義，PD-1、PD-L1表達越高，患者預后越差。

本研究初步顯示，PD-1、PD-L1在OSCC患者中陽性表達率較高，與預后不良有關，可作為預后潛在生物標記物。但本研究選取樣本量較少，PD-1、PD-L1在OSCC中具體作用機制尚需進一步大樣本研究，為OSCC治療提供實驗支持，提高患者預后。