榆林市馬鈴薯早疫病病原分離鑒定與化學(xué)藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定

賀 英，霍治軍，艾海艦，王 梅，霍彥波，王倩茹

（1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000；2.榆林市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)培訓(xùn)中心，陜西 榆林 719000）

馬鈴薯早疫病俗稱(chēng)夏疫病、輪紋病或干斑病，是一種氣傳的多循環(huán)單年流行病害，主要危害植株葉片，也會(huì)感染莖稈和塊莖[1]。馬鈴薯早疫病于1892年在美國(guó)的佛蒙特州首次發(fā)現(xiàn)，目前世界各地均有分布[2]。榆林市為中國(guó)馬鈴薯四大產(chǎn)區(qū)之一，2020年馬鈴薯種植面積全市可達(dá)16.92萬(wàn)hm2[3]。由于氮肥施用量增加和種苗材料品質(zhì)弱等的影響，榆林市早疫病的發(fā)生越來(lái)越普遍與嚴(yán)重，逐漸成為馬鈴薯產(chǎn)量的限制因素，是僅次于晚疫病的第二大真菌病害。目前化學(xué)防治仍是生產(chǎn)上控制馬鈴薯早疫病的重要手段，也是確保馬鈴薯高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要措施[4-7]。但是，生產(chǎn)中長(zhǎng)期大量使用固定幾種農(nóng)藥，使得病原產(chǎn)生抗藥性，防治效果變差，同時(shí)過(guò)度使用農(nóng)藥，引起生態(tài)環(huán)境安全問(wèn)題也亟需解決[8]。植物病原菌的分離與鑒定是病害生物學(xué)、流行病學(xué)研究以及病害有效防控的基礎(chǔ)[9]。然而，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道引起榆林市馬鈴薯早疫病的鏈格孢菌的具體種類(lèi)。因此，明確榆林市馬鈴薯早疫病病原，篩選高效低毒防治藥劑，是馬鈴薯生產(chǎn)和保護(hù)環(huán)境的迫切需求。鑒于此，本研究鑒定榆林市馬鈴薯早疫病病原菌，并通過(guò)室內(nèi)毒力試驗(yàn)，初步確定病原菌株敏感藥劑，為馬鈴薯早疫病田間防治篩選低毒高效藥劑奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果可為榆林市馬鈴薯早疫病的科學(xué)防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料和藥劑

1.1.1 供試材料

對(duì)榆林市馬鈴薯種植主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行早疫病的病葉采集，大田采集后置于冰盒密封標(biāo)記，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試藥劑

供試藥劑名稱(chēng)、劑型、生產(chǎn)廠(chǎng)家及稀釋倍數(shù)見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌種類(lèi)的鑒定

采用常規(guī)組織培養(yǎng)法分離病原菌株，培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA），28℃培養(yǎng)7 d。將分離純化所得不同真菌進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證，得到馬鈴薯早疫病病原菌。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)馬鈴薯早疫病病原菌進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察鑒定。4℃保存菌種備用，將保存的菌種送至奧維森測(cè)序公司進(jìn)行分子鑒定。

1.2.2 含藥培養(yǎng)基的制備

應(yīng)用含毒介質(zhì)法配置PDA 培養(yǎng)基。無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水將各供試藥劑按表1 中的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)⑶腋魅? mL 加入60 mL 的培養(yǎng)基中搖勻后進(jìn)行高壓滅菌，無(wú)菌操作臺(tái)上將各含藥培養(yǎng)基分裝入滅菌后的培養(yǎng)皿中，每個(gè)供試藥劑有5 個(gè)不同稀釋處理，以無(wú)菌水作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

表1 供試藥劑Table 1 Fungicides used in experiment

1.2.3 抑菌活性的測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法，在無(wú)菌條件下，用打孔器在純化的平板菌種菌落邊緣處打直徑為0.8 cm 的菌餅，移至含藥培養(yǎng)基中，放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，5 d 后使用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用MEGA 7 軟件進(jìn)行序列分析，鄰接法（Neighbor-joining， NJ）構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) ，Bootstrap 設(shè)置為1 000；試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019 進(jìn)行整理分析，用IBM SPSS Statistic 23.0 進(jìn)行單因素方差分析并計(jì)算EC50和EC95的值。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯早疫病病原菌分離鑒定結(jié)果

2.1.1 馬鈴薯早疫病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

馬鈴薯早疫病葉片病斑為褐色圓形斑點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大至近圓形，褐色至暗褐色，病斑邊緣明顯，有清晰的同心輪紋，病斑上可產(chǎn)生少許黑色霉?fàn)钗铮▓D1a、圖1b）。采用組織分離法分離馬鈴薯早疫病病原菌，將分離純化所得不同真菌進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證，得到馬鈴薯早疫病病原菌，記作真菌-1，PDA 培養(yǎng)病原菌真菌-1 菌落呈暗黑色（圖1c、圖1d）。顯微觀(guān)察，成熟菌絲呈暗褐色，菌絲有隔膜和分枝（圖1e）。分生孢子自分生孢子梗頂端產(chǎn)生，通常為單生，很少有兩個(gè)成串，倒棍棒形，黃褐色，2～8 個(gè)橫隔膜，0～4 個(gè)縱隔膜，隔膜處有縊縮，大小43～90 μm × 10～15 μm。喙細(xì)長(zhǎng)，與孢體等長(zhǎng)或略短，淡色，有2～7 個(gè)橫隔膜，孢身至喙逐漸變細(xì)（圖1e、圖1f）。根據(jù)中國(guó)真菌志及其相關(guān)文獻(xiàn)查詢(xún)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，鑒定榆林市馬鈴薯早疫病病原菌屬鏈格孢屬（Alternaria）。

圖1 馬鈴薯早疫病癥狀及病原菌落、分生孢子Figure 1 Symptoms, colonies and conidial morphology of potato early blight

2.1.2 馬鈴薯早疫病病原菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

以分離純化的馬鈴薯早疫病病原菌樣本（真菌-1）的基因組DNA 為模板，選擇真菌通用引物ITS1/ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后得到該病原菌株的rDNA-ITS 序列，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)（BLAST）分析發(fā)現(xiàn)，真菌-1 的 rDNA-ITS 序列與NCBI 庫(kù)中的多種鏈格孢屬（Alternaria）真菌高度同源。基于比對(duì)結(jié)果，選擇相似種真菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建（圖2），結(jié)果表明，供試菌株真菌-1 在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中與A.alternata（登錄號(hào)：KX987252.1）聚為一枝，結(jié)合病原菌菌絲、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)（圖1），因此推測(cè)真菌-1 為 A.alternata。

圖2 真菌-1 與相似種的ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Phytophthora infestans 為外群）Figure 2 Phylogenetic tree of fungi-1 rDNA-ITS compared to similar species (Phytophthora infestans as outgroup)

2.2 9 種殺菌劑對(duì)A. alternata 的室內(nèi)毒力測(cè)定

通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定9 種殺菌劑對(duì)A.alternata 的室內(nèi)毒力，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2 中可知，供試殺菌劑對(duì)該病原的抑菌活性按照毒力由大到小的順序依次為：噁酮·氟噻唑（SC）＞異菌·氟啶胺（SC）＞苯甲·百菌清（SC）＞烯酰·吡唑酯（WG）＞氟菌·霜霉威（SC）＞72%霜脲·錳鋅（WP）＞69%烯酰·錳鋅（WP）＞75%代森錳鋅（WG）＞70%丙森鋅（WP）；噁酮·氟噻唑（SC）、異菌·氟啶胺（SC）、苯甲·百菌清（SC）、烯酰·吡唑酯（WG）和氟菌·霜霉威（SC）的EC50值 分 別 為 3.601， 7.493， 21.113， 27.555 和51.874 μg/mL，EC50值在 3～52 μg/mL，EC95值分別為 124.987，489.168，1 338.277，3 011.257 和2 325.134 μg/mL，這表明以上5 種藥劑抑菌效果較好，可供進(jìn)一步田間試驗(yàn)使用，其中噁酮·氟噻唑、異菌·氟啶胺、烯酰·吡唑酯和氟菌·霜霉威隨著有效成分濃度的增加，各藥劑濃度的抑制作用顯著增加，可見(jiàn)在生產(chǎn)中可提高這些藥劑濃度以取得較好的防治效果，苯甲·百菌清隨著有效成分濃度的增加，藥劑濃度對(duì)抑菌率影響不顯著，可見(jiàn)在生產(chǎn)中提高藥劑濃度不能大幅度提升防治效果；75%代森錳鋅和70%丙森鋅的EC50值分別為 1 525.580 和 3 969.600 μg/mL，EC50值在1 500～ 4 000 μg/mL，可見(jiàn) A. alternata 已對(duì)這 2種殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，在田間不可單獨(dú)使用。

表2 9 種化學(xué)試劑對(duì)馬鈴薯早疫病病原菌的室內(nèi)毒力Table 2 Toxicity measurement of different concentrations of fungicides to A. alternata

3 討 論

國(guó)際上已報(bào)道的能引起馬鈴薯早疫病的鏈格孢菌有8 種，中國(guó)已報(bào)道的病原菌只有茄鏈格孢（A. solani）和鏈格孢（A. alternata）兩種[2]，本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定分離所得菌種，首次明確榆林市馬鈴薯早疫病病原菌為鏈格孢（A.alternata）。

本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)藥敏試驗(yàn)篩選了5 種效果較好的藥劑，分別是噁酮·氟噻唑（SC）、異菌·氟啶胺（SC）、苯甲·百菌清（SC）、烯酰·吡唑酯（WG）和氟菌·霜霉威（SC），可供進(jìn)一步田間試驗(yàn)使用。在當(dāng)?shù)伛R鈴薯早疫病防治上并未見(jiàn)使用噁酮·氟噻唑（SC）和異菌·氟啶胺（SC）。噁酮·氟噻唑（SC）通過(guò)對(duì)氧化固醇結(jié)合蛋白（OSBP）抑制達(dá)到抑菌效果，對(duì)卵菌綱病原菌具有獨(dú)特的作用位點(diǎn)，具有內(nèi)吸向頂傳導(dǎo)、保護(hù)新生組織的特點(diǎn)，同時(shí)可以快速被蠟質(zhì)層吸收，具有優(yōu)秀的耐雨水沖刷作用，對(duì)病原菌具有預(yù)防、治療和抑制產(chǎn)孢作用，其具有治療高效、速效、持效、用量低、藥效穩(wěn)定的特點(diǎn)[10]。本試驗(yàn)中，噁酮·氟噻唑（SC）的EC50值為3.601 μg/mL，EC95值為124.987 μg/mL，對(duì)A. alternata 室內(nèi)毒力測(cè)定在9 種藥劑中效果較好，建議在生產(chǎn)中推廣使用。氟啶胺是目前唯一的線(xiàn)粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，在ATP 合成酶上有多個(gè)作用位點(diǎn)，由多基因控制，抗性風(fēng)險(xiǎn)極低，全球至今無(wú)抗性報(bào)道，殺菌速度與活性領(lǐng)先于同類(lèi)化合物[11]。本試驗(yàn)中，測(cè)定異菌·氟啶胺（SC）對(duì)A. alternata 的毒力效果，EC50值為7.493 μg/mL，EC95值為 489.168 μg/mL，是毒力僅此于噁酮·氟噻唑（SC）的藥劑。

本試驗(yàn)測(cè)定得出75%代森錳鋅（WG）和70%丙森鋅（WP）對(duì)馬鈴薯早疫病病原菌的毒力較差。這可能是近幾年來(lái)，榆林市普遍使用75%代森錳鋅（WG）和70%丙森鋅（WP）兩種試劑對(duì)馬鈴薯早疫病進(jìn)行化學(xué)防治，使馬鈴薯早疫病對(duì)75%代森錳鋅（WG）和70%丙森鋅（WP）產(chǎn)生了抗性，因此不建議在田間單獨(dú)使用這兩種農(nóng)藥。

室內(nèi)毒力測(cè)定是田間防效試驗(yàn)的基礎(chǔ)，各藥劑的真實(shí)防效需在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，在田間防治使用時(shí)，建議結(jié)合馬鈴薯早疫病病原菌流行的關(guān)鍵時(shí)期設(shè)置多次噴藥，發(fā)病中心重點(diǎn)施藥等方法，以便取得最好的防治效果；田間防治亦可混合其他藥劑使用，克服和延緩早疫病對(duì)農(nóng)藥的抗藥性，從而保證防治效果。