酸化、低氧對大黃魚非特異性免疫及抗氧化能力的影響

曾 姣，陳 潤，王翠華，彭士明，王 倩，鄭 亮，馬凌波

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090）

大黃魚（Larimichthys crocea）是中國東海區域的主要經濟魚類［1］，其產量在海水養殖魚類中占據第三的位置，且近年來呈現增長的趨勢［2］。而大黃魚對水環境溶氧要求較高［3］，近年來隨著工業的發展，海洋吸收大氣中的CO2導致海水pH下降［4］，東海地區也頻繁出現低氧現象［5］。研究表明，海水中CO2的增加將導致溶解氧的降低，因此海洋生物或將面臨酸化-低氧的雙重脅迫，這將給海水養殖行業帶來巨大的影響［6］。在低氧脅迫下，海洋生物通過抗氧化酶活性變化［7］、代謝底物改變［8］，從而保護機體不受損傷，盡管如此，生物組織仍會受到一定程度的損傷，進而機能出現紊亂［9］，甚至導致魚死亡［10］。酸化會影響海洋生物的鈣化率［11］、呼吸代謝［12］，影響其躲避敵害［13-14］和洄游等行為［15］。在酸化-低氧雙重脅迫下，海洋生物新陳代謝減緩［16］、生理生長性能［17-18］和免疫功能［19］降低，這不僅導致海洋生物變得更容易被捕食［20］，甚至出現大規模死亡的現象［21］。近期關于酸化與低氧的研究，主要集中于其對海洋生物鈣化率［22］、抗病能力［23］、生長率［24］、存活率［25］以及基因表達水平［26］、抗氧化酶活力與非特異性免疫相關酶［19］活力變化的影響，研究對象均以鈣質生物為主。

魚類的特異性免疫相對哺乳動物較低級，而魚類的非特異性免疫在機體免疫中占主要地位［27］。魚類的抗氧化系統為魚類先天免疫的第一道防線，SOD和CAT是抗氧化系統中清除多余活性自由基ROS的主要抗氧化酶，而MDA含量的變化可以有效地表明魚體受氧化損傷的程度［28］。LZM活力作為體液免疫因子，在一定程度上可以反映魚類非特異性免疫能力的強弱［29］。本研究以大黃魚為研究對象，對酸化-低氧給大黃魚的非特異性免疫以及抗氧化能力帶來的影響進行探討分析，以期為減少酸化-低氧對大黃魚的脅迫提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用大黃魚幼魚由東海水產研究所福建福鼎研究基地提供，挑選800尾健康無傷大黃魚，體長（19.5±1.1）cm，體質量（75.6±4.9）g，十月齡，不分雌雄，在一直徑4 m的室內水泥池中預養2周。在此期間每天更換池子中一半的海水，每天早上7點喂食直至實驗開始的前兩天，所投喂飼料為市售配合飼料。

1.2 實驗方案

1.2.1 實驗設計

CALDEIRA等［30］根據政府間氣候變化專門委員會（IPCC）發表的評估報告，預測到2100年海水pH值將會下降0.3～0.5，2300年pH值將下降0.8～1.4。已知健康大黃魚幼魚的溶解氧（DO）窒息點為2.58～2.83 mg·L-1［31-33］，根據已知估算數據，并通過預實驗確定方案可行性后，實驗設置4個處理組：對照組（pH 8.1，DO 7.0 mg·L-1）、低氧組（pH 8.1，DO 3.5 mg·L-1）、酸化組（pH 7.35，DO 7.0 mg·L-1）及酸化-低氧組（pH 7.35，DO 3.5 mg·L-1），每個處理組設置3個平行。

實驗在12個裝有1500 L過濾曝氣海水的玻璃鋼圓桶（直徑1.5 m）中進行，實驗各組通過充入氮氣來調節溶解氧水平，通過充入CO2來調節pH水平，用YSI Pro10萬能水質檢測儀（美國）以及YSI Prosolo溶氧儀（美國）每5 min測定pH以及溶解氧（DO），待池內pH以及DO穩定下來后，將50條健康無傷的試驗魚同時放入每個玻璃鋼圓桶中，等大黃魚適應10 min后開始計時。實驗分為急性脅迫和慢性脅迫兩個階段，急性脅迫取樣時間分別為0、3、6、12、24、48、96 h，慢性脅迫取樣時間分別為7、15、30 d。

1.2.2 樣品收集與處理

采血前24 h對大黃魚進行空腹處理，從每個試驗組隨機取大黃魚6尾，用1%的丁香酚對試驗魚進行麻醉。使用一次性無菌注射器（2 mL）進行尾靜脈采血制作血清用于實驗。采血時針頭使用抗凝劑（1%肝素鈉）潤洗，并將全血分裝在2 mL的離心管，置于冰盒中。采血完成后及時在4℃下，3000 r·min-1離心15 min，吸取離心后的上清液血清于新的1.5 mL離心管中，用Parafilm封口膜封口，放入-80℃冰箱保存用于待測。

采血后在滅菌操作臺上快速解剖取出大黃魚的肝臟，并用預冷的生理鹽水清洗3次，吸干水分后取1 g以上的肝臟放入1.5 mL離心管中，液氮速凍后轉移至180℃高溫滅菌的預冷研缽中充分研磨，研磨后按重量體積比1∶9（g·mL-1）稱取0.1 g組織加入0.9 mL生理鹽水后轉移至新的1.5 mL離心管中，充分震蕩混勻，然后在4℃下，2500 r·min-1離心10 min，取上清液分裝后4℃冰箱暫存，用于測定酶活性。

1.2.3 酶活性的測定

各指標測定均采用南京建成生物有限公司所提供的對應酶測定試劑盒［如：丙二醛（MDA）測定試劑盒］進行測定。LZM活力采用比濁法測定（U·mL-1）、蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍法（mgprot·mL-1）、SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定（U·mgprot-1）、CAT采用可見光比色法測定（U·mgprot-1）、MDA則用TBA法測定（nmol·mgprot-1）。

1.3 數據處理

實驗數據以平均值±標準差（mean±SD）（n＝3）采用IBM SPSSStatistics 25.0軟件進行oneway ANOVA分析，采用Duncan多重比較法檢驗，同時采用雙因素方差分析方法確定低氧與酸化對大黃魚非特異性免疫以及抗氧化酶類的交互作用，P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為極顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 酸化、低氧脅迫對大黃魚非特異性免疫的影響

酸化及低氧脅迫下大黃魚血清LZM活力隨時間的變化趨勢如圖1所示，對照組LZM活力在實驗期間變化幅度較為平緩；酸化組的LZM活力在3 h時出現升高，然后在6～12 h時降低，從12 h時又開始遞增至48 h出現峰值，并顯著高于其他時間點（P＜0.05）；低氧組的LZM活力在3 h時出現增加，在6 h時出現降低后開始遞增，至96 h出現峰值并極顯著高于其他時間點（P＜0.01）；酸化-低氧組的LZM活力在3 h時低于初始水平，隨后顯著高于初始水平（P＜0.05），在48 h時達到峰值并極顯著高于其他時間點（P＜0.01）。在慢性脅迫下，酸化-低氧組、酸化組、低氧組均表現出隨著時間的延長恢復至初始水平的趨勢。結果表明，酸化組的LZM活力在3、6、24、48 h和7、15、30 d時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01），96 h時存在顯著性差異（P＜0.05）；低氧組的LZM活力在3、48、96 h和7、30 d時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01），12 h、15 d時存在顯著性差異（P＜0.05）；酸化-低氧組的LZM活力在6、24、48、96 h和7、15 d時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01），12 h時存在顯著性差異（P＜0.05）。

酸化及低氧對大黃魚血清LZM活力各時期影響的交互作用分析結果見表1。從表1可以看出，僅從單一因子而言，低氧對大黃魚血清LZM活力在6、24、48 h和15 d時具有極顯著性影響（P＜0.01），12 h、7 d時存在顯著性影響（P＜0.05）；酸化對大黃魚血清LZM活力在48、96 h和7、15 d時具有極顯著性影響（P＜0.01），3 h時存在顯著性影響（P＜0.05）；酸化-低氧的交互作用對大黃魚血清LZM活力在3、48 h和30 d時表現出了極顯著性影響（P＜0.01），在7 d時表現出了顯著性影響（P＜0.05）。

表1 酸化以及低氧對大黃魚血清LZM活力各時期影響的雙因素分析Tab.1 Two-factor analysis of effects of acidification and hypoxia on serum LZM activity of Larimichthys crocea in different periods

2.2 酸化、低氧脅迫對大黃魚抗氧化能力的影響

酸化及低氧脅迫下大黃魚肝臟SOD含量隨時間變化情況如圖2所示。實驗期間對照組SOD含量無顯著變化；酸化組的SOD含量則在12 h時出現最低值，其余時間點SOD含量與初始值無顯著性差異（P＞0.05）；低氧組的SOD含量一直處于顯著高于初始水平狀態并在24 h時達到峰值（P＜0.05）；酸化-低氧組的SOD含量一直處于顯著高于初始水平的狀態（P＜0.05），在30 d達到峰值，并顯著高于其他時間點以及其他處理組（P＜0.05）。慢性脅迫下，低氧組及酸化組大黃魚肝臟SOD含量呈現出恢復至初始水平的趨勢。結果表明，酸化組的SOD含量在3、12、24、96 h時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01），15 d時存在顯著性差異（P＜0.05）；低氧組的SOD含量在3、6、12、24、48、96 h及7 d時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01），在15 d時存在顯著性差異（P＜0.05）；酸化-低氧組的SOD含量在3、6、12、24、48、96 h及7、15、30 d任一脅迫時間點都與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01）。

圖2 酸化、低氧對大黃魚肝臟SOD含量的影響Fig.2 Effect of acidification and hypoxia on liver SOD content of Larimichthys crocea

酸化以及低氧對大黃魚肝臟SOD含量各時期影響的交互作用分析結果見表2。從表2可以看出，僅從單一因子而言，低氧對大黃魚肝臟SOD含量在12、96 h及30 d時具有極顯著性影響（P＜0.01），3 h時存在顯著性影響（P＜0.05）；酸化對大黃魚肝臟SOD含量在3、6、12、24、48、96 h及7、15、30 d任一脅迫時間點均具有極顯著性影響（P＜0.01）；酸化以及低氧兩者的交互作用對大黃魚肝臟SOD含量在12、24 h及30 d時表現出了極顯著性影響（P＜0.01）。

表2 酸化以及低氧對大黃魚肝臟SOD含量各時期影響的雙因素分析Tab.2 Two-factor analysis of effects of acidification and hypoxia on liver SOD content of Larimichthys crocea in different periods

酸化及低氧脅迫下大黃魚肝臟CAT活力隨時間變化情況如圖3所示。對照組CAT活力實驗期間變幅較為平緩；酸化組的CAT活力則整體呈現出先升高后降低再升高的趨勢；低氧組的CAT活力則在12 h時突然升高并達到最高峰（P＜0.05）；酸化-低氧組的CAT活力隨著時間的延長呈現先升高后降低而后升高的趨勢，在12 h時達到峰值。在慢性脅迫下，酸化-低氧組及低氧組呈現出恢復至初始水平的趨勢。結果表明，酸化組的CAT活力在3、6、12、24、48、96 h及7、30 d脅迫時間點與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01），15 d時存在顯著性差異（P＜0.05）；低氧組的CAT活力在12、24、48、96 h及7、30 d脅迫時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01），15 d時存在顯著性差異（P＜0.05）；酸化-低氧組的CAT活力在3、6、12、24、96 h及7、15、30 d脅迫時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01）。

圖3 酸化、低氧對大黃魚肝臟CAT活力的影響Fig.3 Effect of acidification and hypoxia on liver CAT activity of Larimichthys crocea

酸化以及低氧對大黃魚肝臟CAT活力各時期影響的交互作用分析結果見表3。從表3可以看出，僅從單一因子而言，低氧在3、6、12、24、48、96 h及7、30 d時對大黃魚肝臟CAT活力具有極顯著性影響（P＜0.01），15 d時存在顯著性影響（P＜0.05）；酸化在12、24、48、96 h及7、30 d時對大黃魚肝臟CAT活力具有極顯著性影響（P＜0.01），6 h時存在顯著性影響（P＜0.05）；酸化-低氧的交互作用在6、24、48、96 h及7、30 d時對大黃魚肝臟CAT活力表現出了極顯著性影響（P＜0.01）。

表3 酸化以及低氧對大黃魚肝臟CAT活力各時期影響的雙因素分析Tab.3 Two-factor analysis of effects of acidification and hypoxia on liver CAT activity of Larimichthys crocea in different periods

酸化及低氧脅迫下大黃魚肝臟MDA含量隨時間變化情況如圖4所示。對照組MDA含量實驗期間變幅較為平緩；酸化組的MDA含量整體呈現先升高后降低的趨勢，在24 h時達到峰值，并顯著高于其他時間點（P＜0.05），而后開始下降并逐漸接近初始水平；低氧組的MDA含量在3 h時出現降低，從7 d開始呈現升高趨勢，在第30天達到最高峰，并顯著高于其他時間點（P＜0.05）；酸化-低氧組的MDA含量隨著時間的推移在3 h時出現降低，在12 h時達到最高值，并顯著高于其他時間點（P＜0.05）。慢性脅迫下，酸化-低氧組、酸化組呈現出恢復至初始水平的趨勢。結果表明，酸化組的MDA含量在3、6、12、24、48、96 h及15、30 d脅迫時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01），在7 d脅迫時存在顯著性差異（P＜0.05）；低氧組的MDA含量在3、6、12、24、48、96 h及7、15、30 d任一脅迫時間點都與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01）；酸化-低氧組的MDA含量在3、12、24、48、96 h及7、15、30 d脅迫時與對照組存在極顯著性差異（P＜0.01）。

圖4 酸化、低氧對大黃魚肝臟MDA含量的影響Fig.4 Effect of acidification and hypoxia on liver MDA content of Larimichthys crocea

酸化以及低氧對大黃魚肝臟MDA含量各時期影響的交互作用分析結果見表4。從表4可以看出，僅從單一因子而言，低氧在3、6、12、24、48、96 h和7、30 d時對大黃魚肝臟MDA含量具有極顯著性影響（P＜0.01）；酸化在3、6、12、48、96 h和7、15、30 d時對大黃魚肝臟MDA含量具有極顯著性影響（P＜0.01），3 h時存在顯著性影響（P＜0.05）；酸化-低氧的交互作用在6、12、24、48、96 h和7、15、30 d時對大黃魚肝臟MDA含量表現出了極顯著性影響（P＜0.01）。

表4 酸化以及低氧對大黃魚肝臟MDA含量各時期影響的雙因素分析Tab.4 Two-factor analysis of effects of acidification and hypoxia on liver MDA content of Larimichthys crocea in different periods

3 討論

3.1 酸化、低氧對大黃魚非特異性免疫的影響

魚類的特異性免疫相對哺乳動物較低級，魚類的非特異性免疫在機體免疫中占主要地位［27］。在非特異性免疫中，LZM活力作為體液免疫因子，是機體防御的第一道防線，是吞噬細胞能否殺死細菌的決定性要素［34］。血清中的LZM活力主要來自吞噬細胞［35］和血細胞［36］，受到免疫刺激或接觸到抗原性物質將導致其活力上升。測定LZM活力在一定程度上可以反映魚類非特異性免疫能力的強弱［29］。本文結果顯示，酸化及低氧將顯著影響大黃魚血清中的LZM活力（P＜0.05）。據研究報道，魚體LZM活力的最佳pH值為7.5［37］，因此酸化組的LZM活力均高于對照組的LZM活力，這與孫漢等［38］在pH7.5以及pH7.8條件下檢測的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）LZM活力結果相似。而低氧組的LZM活力在12 h時低于對照組，但其余時間段均高于對照組，這可能是因為當天水溫波動（18.2～20.8℃）使得LZM活力降低［34］。酸化-低氧組中大黃魚血清LZM活力呈現先降低后升高的趨勢，這與酸化及低氧脅迫下貽貝（Mytilus coruscus）的LZM活力先升高后降低的趨勢不一致［18］，可能是因為大黃魚的肝臟組織作為主要免疫組織在應對酸化和低氧雙重脅迫時產生了比貽貝消化腺更強的免疫反應［39］。在酸化-低氧雙重脅迫、酸化脅迫、低氧脅迫下，LZM活力都有恢復至原始水平的趨勢，這與王文博［40］的研究結果一致，可能是魚體產生了一定的耐受性［41］，但也有可能是長時間的脅迫環境導致魚體內生理紊亂，從而使得LZM活力下降［42］。

3.2 酸化、低氧對大黃魚抗氧化能力的影響

魚類的抗氧化系統為魚類先天免疫的第一道防線，SOD和CAT是抗氧化系統中清除多余活性自由基ROS的主要抗氧化酶，而MDA含量的變化可以有效地表明魚體受氧化損傷的程度［28］。本實驗中，低氧組的SOD含量、CAT活力及MDA含量變化趨勢與王永紅等［43］對大黃魚進行低氧脅迫的研究結果一致，證明在低氧的慢性脅迫下，大黃魚幼魚抗氧化系統未能有效地緩解ROS帶來的損傷。而酸化組的SOD含量與對照組并不存在顯著性差異，這與酸化條件下草魚（Ctenopharyngodon idellus）SOD含量變化趨勢相似［44］，其原因可能是在酸化情況下產生了過多的H＋促使更多的活性氧生成，O2-被SOD還原成H2O2導致SOD含量減少［45］，由于SOD未能清除完大部分多余的ROS自由基［46］，因此CAT活力呈現先升高后降低而后再升高的趨勢，這與酸化脅迫下凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的CAT活力變化趨勢一致［47］，隨著SOD和CAT對ROS自由基的清除，MDA含量呈現先增加后減少的趨勢，證明在慢性脅迫下出現了適應機制，此結果與韓星星等［48］的結果相似。急性脅迫下，酸化-低氧組的SOD含量以及CAT活力均顯著高于對照組（P＜0.05），該趨勢與貽貝在酸化以及低氧脅迫下的實驗結果相似［49］。在酸化-低氧雙重脅迫下為了消除多余的活性自由基，SOD含量以及CAT活力均大幅增長，而在96 h出現減少的情況可能是因為長期的脅迫導致魚體內出現了暫時的紊亂，從而導致SOD含量下降，連帶CAT活力也受到一定的影響。在此種情況下MDA含量呈現先增加后減少的趨勢，這表明在SOD和CAT協同作用下，多余的ROS自由基得到了消除，減少了魚體的損傷。這可能是魚類在酸化及低氧環境下的一種自我調節機制，具體仍需進一步研究探討。

4 小結

本實驗評估了不同時間尺度下酸化及低氧兩種脅迫對大黃魚非特異性免疫與抗氧化功能的影響。從檢測的免疫和抗氧化指標來看，急性脅迫較慢性脅迫對大黃魚的非特異免疫、抗氧化反應的影響更為明顯，慢性脅迫條件下雖然大黃魚對免疫、抗氧化指標具有一定的自我調控作用，但仍受到一定影響。由此證明，在酸化-低氧情況下大黃魚存在一定的自我調節機制，但酸化-低氧不管是單一因子還是交互作用均對大黃魚的非特異性免疫與抗氧化能力存在一定程度的脅迫影響，其中的內在影響機理尚需進一步研究探討。本研究結果可為大黃魚健康養殖和逆境生理功能調節研究提供部分基礎數據。