磷酸化53BP1在乳腺癌中的表達及其意義

范明江，閆魯霞，徐 蕾，張 園，熊廷川，朱長軍

（1.新疆喀什地區第一人民醫院，新疆維吾爾自治區 喀什844000；2.天津師范大學生命科學學院，天津300387；3.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；4.新疆醫科大學第三臨床醫院（附屬腫瘤醫院）腫瘤防治研究所，烏魯木齊830011）

基因組不穩定是腫瘤細胞的重要標志，引起基因組不穩定的原因是細胞周期調控、DNA復制以及DNA損傷修復分子通路中的相關蛋白發生突變或者錯誤表達導致的基因功能異常[1].P53基因是一種廣譜的腫瘤抑制基因，其產物P53具有調節細胞生長、凋亡和DNA修復的作用.P53結合蛋白1（p53 binging protein，53BP1）能夠與P53相互結合，其基因定位在人15號染色體長臂1區5帶~2區1帶，全長6.6 kb，編碼1 972個氨基酸，蛋白相對分子質量為217×103[2].53BP1可在修復DNA雙鏈斷裂損傷（DSB）途徑中發揮重要作用.Li等[3]研究發現，在DSB發生后第一時間53BP1可被蛋白激酶ATM磷酸化且聚集在DNA損傷處，ATM磷酸化的53BP1持續聚集在DNA損傷位點，能夠阻止DNA雙鏈損傷的正常同源重組修復，最終引起細胞基因組不穩定，導致腫瘤發生.

乳腺癌是一種常發生于乳腺上皮組織的的婦科惡性腫瘤[4].按照乳腺癌細胞表面雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、表皮生長因子2受體（HER-2）等表達的不同，可將乳腺癌分為Luminal A、Luminal B、HER2陽性和三陰性等類型.Luminal A型乳腺癌的特點為：ER+、和/或PR+、HER2-，與其他類型乳腺癌相比較，Luminal A型乳腺癌預后相對較好.Luminal B型乳腺癌的特點為：ER+、和/或PR+、HER2+，Luminal B型乳腺癌腫塊大，組織學分級高，易發生脈管轉移和淋巴結轉移.HER2過表達型乳腺癌的特點為：ER-、PR-、HER2+，該亞型乳腺癌所占比例約為20%.三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的特點為：ER-、PR-、HER2-，該亞型乳腺癌所占比例為15%~20%[5].乳腺癌種類繁多，危害極大，但目前臨床上仍缺少特異性早期分子診斷的方法.

本研究通過制備特異性抗磷酸化53BP1血清，應用免疫共沉淀技術結合蛋白免疫印跡雜交實驗、細胞免疫熒光染色等方法，對抗磷酸化53BP1抗體的特異性進行檢測驗證，以期揭示磷酸化53BP1抗體與乳腺癌發生發展的關系.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

根據磷酸化53BP1蛋白分子一級結構中的第25位和第29位氨基酸設計制備磷酸化53BP1抗體的抗原多肽CIEDpSQPEpSQVLEDD，由杭州丹港生物科技有限公司合成；通用型免疫組化試劑盒，武漢博士德生物公司；乳腺癌組織芯片，上海卓灝醫藥科技有限公司（芯片編號：BRC2281）.

1.2 實驗方法

1.2.1 磷酸化53BP1抗體制備

磷酸化53BP1抗體由實驗室自主制備，經蛋白免疫共沉淀（IP）、免疫印跡雜交（WB）、免疫熒光染色（IF）驗證了抗體的特異性[6].

1.2.2 免疫組化染色檢測

應用通用型免疫組化試劑盒進行免疫組化染色實驗.首先是烘片，將石蠟切片放置在60℃烘箱中烘片至少60 min，之后在二甲苯中進行脫蠟處理，將脫蠟好的石蠟切片依次完全浸入不同濃度的乙醇中進行水化處理，然后使用EDTA修復液進行修復，用PBS漂洗修復好的石蠟切片3次，每次5 min.使用3%的雙氧水完全浸沒石蠟切片，室溫下避光封閉30 min，再加PBS漂洗石蠟切片3次，每次5 min.使用0.1%PBST配制的5%BSA抗原封閉液，室溫封閉60 min，封閉內源性抗原.接著一抗孵育，加適量磷酸化53BP1抗血清（1∶1000）于組織切片上，4℃條件下過夜，然后用PBS漂洗3次，每次5 min.滴加適量HRP標記過的二抗工作液，室溫孵育60 min.將DAB顯色液滴加至甩干的石蠟組織上，蘇木精復染，將潤洗過的石蠟切片沒入蘇木精染液中.之后按下列步驟進行組織脫水：70%乙醇5 min，85%乙醇5 min，90%乙醇5 min，95%乙醇5 min，100%乙醇10 min，100%乙醇10 min.最后滴加適量的中性樹脂封片，掃描石蠟組織切片并保留樣品染色圖像.

1.2.3 免疫組化染色結果分析

利用Image scope X64軟件采集免疫組化的圖像，應用Image-Pro Plus熒光分析軟件對圖像進行分析.根據熒光染色的深淺，即光密度值（OD）以及分布面積大小來確定目標蛋白的量，將圖片上各點的光密度值累加起來，除以目標分布區域的面積，得到平均光密度值（IOD）.通過計算IOD值的大小，對各樣品的圖像進行定量分析.與人工計數法相比，該方法不僅能夠提高定量分析的精確度，還可以避免觀察者主觀因素的干擾，重復性好，可信度高[7].

1.2.4 生物統計結果分析

采用SPSS17.0軟件對數據進行統計分析，通過獨立樣本T檢驗，差異具有高度統計學意義（P＜0.001）.

2 結果與分析

2.1 磷酸化53BP1在乳腺癌組織芯片中的免疫組織化學染色

通過免疫組織化學染色技術，應用特異性磷酸化53BP1抗血清對乳腺癌組織芯片進行免疫組織化學染色，染色結果如圖1所示.其中，A1~A8是8例非惡性癌的乳腺組織（non-cancer，NC），其余為220例乳腺癌組織（tumour）.由于A19、F15、F19、I6、K8樣本嚴重脫片，沒有采集到滿意圖像，因此這5例病例均未放入結果統計范圍中.

圖1 磷酸化53BP1在乳腺癌組織芯片中的免疫組織化學染色Fig.1 Immunohistochemical staining of phosphorylated 53BP1 in breast cancer tissue microarrays

2.2 磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達情況的比較

利用Image-Pro Plus分別計算抗磷酸化53BP1抗體在220個乳腺癌組織和8例非癌乳腺組織中染色的平均光密度值，IOD大小代表組織標本中磷酸化53BP1的表達量.采用獨立樣本T檢驗分析數據，結果如圖2（a）所示，磷酸化53BP1在乳腺癌組織標本中的平均表達量為（0.079±0.027），顯著高于非癌乳腺組織標本中的平均表達量（0.036±0.007）.通過獨立樣本T檢驗證實，差異具有高度統計學意義（P＜0.001）.隨機選取非癌乳腺組織與癌組織染色結果進行比較，如圖2（b）所示，癌組織中目標蛋白的棕色顏色更加明顯.

圖2 磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達Fig.2 Expression of phosphorylated 53BP1 in breast cancer tissues and non-cancer tissues

2.3 磷酸化53BP1在不同TNM分期乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達情況的比較

利用上述磷酸化53BP1的染色結果并結合病例的TNM分期資料（Ⅰ期的病例數目為20例，Ⅱ期的病例數目為141例，Ⅲ期的病例數目為37例，無Ⅳ期的病例），分析不同TNM分期中磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達差異，結果如圖3（a）所示.選取TNM分期中典型乳腺癌組織與非癌乳腺組織的染色圖片進行觀察比較，結果如圖3（b）所示.磷酸化53BP1在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期癌組織標本中的平均表達量分別為（0.080±0.019）、（0.078±0.025）和（0.084±0.035），在非癌組織標本中的平均表達量為（0.036±0.007）.經獨立樣本T檢驗證實，磷酸化53BP1在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期癌組織中的平均表達量均顯著高于非癌組織中的平均表達量，差異具有高度統計學意義（P＜0.001）.

圖3 磷酸化53BP1在不同TNM分期乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達Fig.3 Expression of phosphorylated 53BP1 in different TNM stages of breast cancer tissues and non-cancer tissues

2.4 磷酸化53BP1在不同病理分級乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達情況的比較

乳腺癌組織芯片中組織病理分級：I級的病例數目為7例，Ⅰ-Ⅱ級的病例數目為8例，Ⅱ級的病例數目為82例，Ⅱ-Ⅲ級的病例數目為89例，Ⅲ級的病例數目為22例，因Ⅰ級、Ⅰ-Ⅱ級的病例數目較少，將其合并分析.不同病理分級乳腺癌組織中磷酸化53BP1的表達與非癌乳腺組織中的表達差異如圖4（a）所示.選取典型的不同病理分級乳腺癌組織染色圖像與非癌組織的圖像進行比較，結果如圖4（b）所示.在Ⅰ和Ⅰ-Ⅱ級癌組織標本中磷酸化53BP1的平均表達量為（0.072±0.029），在Ⅱ級癌組織標本中表達量為（0.081±0.023），在Ⅱ-Ⅲ級癌組織標本中的表達量為（0.079±0.028），在Ⅲ級癌組織標本中的表達量為（0.082±0.025）；非癌組織中的表達量為（0.036±0.007）.經獨立樣本T檢驗，在Ⅰ和Ⅰ-Ⅱ級、Ⅱ級、Ⅱ-Ⅲ級和Ⅲ級癌組織中，磷酸化53BP1的平均表達量均顯著高于非癌組織中的表達量，差異具有高度統計學意義（P＜0.001）.

圖4 磷酸化53BP1在不同病理分級乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達Fig.4 Expression of phosphorylated 53BP1 in different pathological grades of breast cancer and non-cancer tissues

2.5 磷酸化53BP1在不同類型乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達情況的比較

按照乳腺癌組織中雌激素受體、孕激素受體、表皮生長因子2受體等表達的不同，可將乳腺癌分為Luminal A、Luminal B、HER2陽性和三陰性乳腺癌，將不符合ER、PR、HER-2表達檢測指標的乳腺癌患者歸結為其他類型.結合病歷資料分析可知，220例乳腺癌組織中，Luminal A病例數目為55例，Luminal B病例數目為25例，HER2陽性病例數目為48例，三陰性乳腺癌病例數目為26例，其他類型的乳腺癌病例數目為66例.利用磷酸化53BP1的染色結果并結合病例資料，分析不同類型的乳腺癌組織與非癌組織中磷酸化53BP1的表達，結果如圖5（a）所示.選取典型的不同類型乳腺癌組織染色圖片與非癌組織染色圖片進行對比，結果如圖5（b）所示.磷酸化53BP1蛋白在Luminal A型、Luminal B型、HER2陽性、三陰性以及其他類型乳腺癌組織標本中的平均表達量分別為（0.086±0.029）、（0.078±0.028）、（0.077±0.020）、（0.079±0.031）、（0.074±0.027）；在非癌組織中的平均表達量為（0.036±0.007）.經獨立樣本T檢驗證實，磷酸化53BP1在不同類型的乳腺癌組織中的表達量均顯著高于非癌組織中的表達量，差異具有高度統計學意義（P＜0.001）.

圖5 磷酸化53BP1在不同類型乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達Fig.5 Expression of phosphorylated 53BP1 in different types of breast cancer tissues and non-cancer tissues

3 討論與結論

細胞在生長增殖等正常生命活動過程中，常常發生遺傳物質DNA的雙鏈斷裂損傷（DSB）.如果DSB不能正常修復，除引起細胞死亡外，還可能引起細胞基因組不穩定，導致腫瘤的發生發展.真核細胞有2種主要的修復途徑應對DSB損傷：同源重組修復（homologous recombination，HR）和非同源末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）.HR需要同源DNA序列作為模板進行修復，而NHEJ直接連接被切斷的DNA受損的末端[8].當細胞發生DSB時，在DNA損傷位點處蛋白激酶ATM被活化，進而使聚集在此區域的53BP1發生磷酸化.磷酸化的53BP1與RIF1結合形成復合物聚集在DSB處，抑制細胞進行同源重組修復[9].此時，乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）通過激活下游底物PP4C（protein phosphatase 4 catalytic subunit）等促進磷酸化的53BP1發生去磷酸化.去磷酸化的53BP1蛋白與RIF1分離，促使斷裂的DNA以未損傷的姐妹染色單體的同源序列作為修復模板，進行DNA同源重組修復，最終保證細胞基因組的完整性[10].如果由各種原因導致DSB位點的53BP1持續處于磷酸化狀態，將抑制細胞同源重組修復的正常進行，導致細胞基因組不穩定，引起腫瘤發生.

本研究通過對220例乳腺癌組織中53BP1蛋白的磷酸化水平進行免疫組化檢測，利用Image-Pro Plus熒光分析軟件對圖像進行分析，發現磷酸化53BP1在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于非癌對照乳腺組織中的表達水平，在不同TNM分期、病理分級以及不同類型的乳腺癌組織中的平均表達量均顯著高于非癌對照乳腺組織中的表達量（P＜0.001）.這些結果表明，磷酸化53BP1與乳腺癌的發生、發展密切相關，是一個潛在的能反映乳腺癌發生、發展的分子標志物，可應用于早期乳腺癌的篩查和診斷.