實時熒光跨越式滾環等溫擴增熔解曲線法檢測復合調味料中的沙門氏菌

陳秀玲，楊倩，郭威，張蘊哲，袁耀武，張偉,,*

(1.河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071001；2.河北農業大學 理工學院，河北 滄州 061100；3.河北農業大學 生命科學學院，河北 保定 071001)

復合調味料經加工后可制成液態、半固態或固態產品[1]。隨著經濟的發展，消費者對易烹飪和耗時少的食品的需求不斷增加[2]。復合調味料因便捷、高效的特點，在餐飲企業、食品加工業及家庭廚房中廣受歡迎[3]。其主要原料包括咸味料、香辛料和鮮味料等，原料種類繁多可能會導致復合調味料在生產及加工過程中受沙門氏菌污染[4-8]。沙門氏菌易生存，即使在水分活度較低或含鹽環境中仍能存活，且隨著水分活度降低，熱阻能力增加，更使其難以滅活[9-12]。因此，復合調味料中可能存在沙門氏菌污染的風險，對公共健康造成威脅。2018年首次發布關于復合調味料的國家標準(GB 31644-2018)，要求沙門氏菌不得檢出[13]。

沙門氏菌能導致人及動物患病，是引起食源性疾病的最主要因素之一[14-16]。其感染劑量較低，對于高度易感染人群僅需15～20 CFU/g即可引起感染[17]。人體感染沙門氏菌后可能會出現腹瀉、腹痛等癥狀，嚴重時甚至會導致死亡[18-19]。因此，開發特異、靈敏、快速的檢測新方法，可及時檢出沙門氏菌，避免食物中毒。

本研究團隊發明的跨越式滾環擴增技術(saltatory rolling circle amplification，SRCA)，在BstDNA聚合酶的作用下僅需一對引物即可在恒溫條件下實現擴增[20]，其反應原理見圖1，在BstDNA聚合酶作用下擴增反應會跨越線性DNA兩端缺口，隨后置換先前的延伸產物。先前的擴增產物像“盒尺一樣不斷被拉長”，最終產生大量不同長度的雙鏈DNA，該方法已成功用于食源性致病菌的檢測[21-23]。

圖1 SRCA反應原理圖Fig.1 The schematic diagram of SRCA reaction

本研究將SRCA技術與熒光技術相結合，擬建立實時熒光跨越式滾環等溫擴增熔解曲線法檢測復合調味料中沙門氏菌的方法，為復合調味料的質量安全保駕護航。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 復合調味料的選擇

沙拉醬：由江蘇亞克西食品有限公司生產。

1.1.2 試驗菌株

本研究共采用39株菌進行特異性分析，包括14株沙門氏菌和25株非沙門氏菌(見表1)，所有菌株均在-80 ℃下保存于10%(W/V)甘油液中。

表1 試驗菌株Table 1 The strains used in the experiment

1.1.3 主要培養基與試劑

營養肉湯、亞硫酸鉍(BS)瓊脂培養基和木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂培養基：均購于北京陸橋技術有限公司。8000 U/mLBstDNA聚合酶：購于美國NEB有限公司；20×EvaGreen熒光染料：購于Biotium公司；SRCA引物：購于北京華大基因有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix：購于北京索萊寶科技公司。

DNA提取試劑盒TIANamp Bacteria Genomic DNA Kit：購于天根生化科技公司；基因克隆T4載體試劑盒、基因克隆試劑盒pMD18-T Vector Cloning Kit：均購于大連寶生物工程公司；凝膠回收試劑盒EasyPure?Quick Gel Extraction Kit、感受態細胞Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell：均購于北京全式金生物技術公司；沙門氏菌生化鑒定試劑盒：購于北京陸橋技術公司。

1.1.4 試驗儀器與設備

參考鄭陸的動物訓練模型[6] ，運動組動物均進行一次性力竭離心運動(持續下坡跑)，依次進行第I級負荷(0°，8.2m/min)15min(相當于53%VO2max)、第II級負荷(-5°，15m/min)15min(相當于64%VO2max)、第III級負荷(-10°，19.3m/min)(相當于76%VO2max)直至力竭。力竭標準為長時間運動后，大鼠趴伏于跑臺上，在驅趕下也不能進行移動。

ABI Step One Plus實時定量PCR儀 美國應用生物系統公司；T-Gradient Thermoblock RF-PCR擴增儀 德國Biomedizinische Analytik公司；DYY-10C電泳儀 北京市六一儀器廠；JY04S-3E凝膠成像系統 北京君意電泳設備公司；無菌均質機 西安比朗生物科技公司；Nanodrop 2000分光光度計 美國Thermo科技公司；電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器公司；三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養與DNA提取

將鼠傷寒沙門氏菌從凍存管中接種到營養肉湯中，用活化后傳代培養3次的菌株進行選擇性分離，從LB瓊脂平板上挑取鼠傷寒沙門氏菌接種到營養肉湯液體培養基中，在37 ℃下，以220 r/min培養過夜，用于提取沙門氏菌基因組DNA。其他菌株在其適宜的培養基上活化完成后，挑取單菌落在斜面上劃線培養，并保存在4 ℃下，備用。

采用商業試劑盒提取法進行模板DNA的提取，所提DNA模板通過Nanodrop 2000分光光度計對其濃度和純度進行測定，選擇質量好的模板于-20 ℃備用。

1.2.2 引物設計

本研究中選擇沙門氏菌高度保守的invA基因設計引物。通過NCBI進行序列比對，選擇特異性強、高度保守性的序列，最后確定沙門氏菌序列(GenBank：ALFE01000410.1)。利用DNAMAN和Primer Premier 5.0軟件設計引物，由北京華大公司進行引物合成。RF-SRCA引物序列見表2。

表2 試驗所用引物Table 2 The primers used in the experiment

1.2.3 RF-SRCA及RF-PCR反應體系

RF-SRCA熔解曲線方法總反應體積為20 μL，包括5 μL dNTPs(終濃度0.625 mmol/L)，3 μL MgSO4(終濃度3.00 mmol/L)，2.5 μL 2×ThermoPol?Reaction Buffer，1 μL上游引物(終0.50 μmol/L)，1 μL下游引物(終0.50 μmol/L)，模板DNA為1 μL(陰性不添加)，8 UBstDNA聚合酶，0.8 μL 20×EvaGreen染料，4.7 μL無菌去離子水。94 ℃下預變性3 min，冰浴2 min；62 ℃下反應60 min，每1 min收集一次熒光信號；反應完成后從70 ℃以3.0 ℃/s的速度升溫至95 ℃，繪制成熔解曲線。

為評價RF-SRCA方法，本研究與RF-PCR的靈敏度和檢出限進行比較。RF-PCR反應體系為：2×EasyTaqPCR SuperMix(11 μL)，沙門氏菌上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL(陰性不添加)，EvaGreen染料0.8 μL，加去離子水補至25 μL。RF-PCR的反應程序：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環；72 ℃再延伸5 min終止反應。熔解曲線分析程序：95 ℃加熱15 s，降溫至70 ℃，然后以0.3 ℃/s的速度升溫至95 ℃，生成熔解曲線。

1.2.4 RF-SRCA產物熔解曲線分析

對RF-SRCA擴增產物進行熔解曲線分析，根據熔解曲線的熔解峰形及Tm值對擴增結果進行分析。陽性結果為單一尖銳熔解峰且Tm值在穩定范圍，陰性無熔解峰。

1.2.5 RF-SRCA產物測序分析

擴增試驗結束后，將反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳試驗。紫外燈下選取典型的梯形條帶，按由下至上的順序切膠回收4條目的片段，隨后對RF-SRCA擴增產物進行純化測序分析。

1.2.6 RF-SRCA引物特異性分析

為評價RF-SRCA引物的特異性，選取14株沙門氏菌，25株非沙門氏菌(見表1)，以無菌去離子水作為陰性對照，并通過熔解曲線法進行引物特異性分析。

1.2.7 靈敏度分析

為評估RF-SRCA熔解曲線方法檢測沙門氏菌的靈敏度，取1 mL上述培養的新鮮菌液，采用試劑盒法提取全基因組DNA。經Nanodrop 2000分光光度計分析，確定沙門氏菌的濃度為60 ng/μL。用無菌去離子水對模板進行10倍梯度稀釋，獲得模板濃度范圍為60 ng/μL～0.6 fg/μL。對各個梯度的模板進行RF-SRCA反應。擴增完成后通過熔解曲線法確定其靈敏度，同時與RF-PCR方法的靈敏度做比較。

1.2.8 人工污染沙拉醬中沙門氏菌的檢出限分析

取25 g 不含沙門氏菌的沙拉醬加入到225 mL無菌生理鹽水中均質，取1 mL沙門氏菌純菌液加入上述9 mL均質液中，吹吸混勻后，用已滅菌的生理鹽水對其進行10倍梯度連續稀釋。根據平板計數法獲得人工污染的沙拉醬中沙門氏菌濃度范圍為4.6×10-1～4.6×108CFU/g。每個稀釋度取1 mL菌懸液用于基因組DNA提取，通過分析，確定RF-SRCA熔解曲線法方法的檢出限，并與RF-PCR方法檢出限進行比較。

續 表

2 結果分析

2.1 RF-SRCA產物熔解曲線分析

在擴增過程中熒光染料EvaGreen會嵌入雙鏈DNA的溝壑中，產生熒光信號。隨著程序溫度升高，DNA雙鏈解開導致熒光染料釋放，熒光信號隨著溫度的變化而發生改變。不同擴增產物根據產物長度及GC含量不同，會出現不同特征峰。SRCA產物熔解曲線結果見圖2，沙門氏菌的熔解曲線有單一尖銳熔解峰，無雜峰，表明沙門氏菌擴增產物可通過熔解曲線進行分析。

圖2 熔解曲線分析Fig.2 The analysis of melting curve

2.2 RF-SRCA產物測序分析

為驗證RF-SRCA擴增反應結果，對圖3中A擴增產物的電泳條帶(1～4)進行測序分析。沙門氏菌擴增產物測序結果見圖3中C，通過分析可知，RF-SRCA產物由多條重復序列串聯構成，且擴增產物由長度不同的片段組成，與凝膠電泳梯度條帶相符。因此，可以驗證本研究建立的RF-SRCA體系檢測沙門氏菌擴增結果的正確性。

圖3 RF-SRCA反應的測序分析Fig.3 The sequencing analysis of RF-SRCA reaction注：圖A為RF-SRCA陽性擴增電泳結果，M為100 bp ladder marker，泳道1為沙門氏菌RF-SRCA陽性擴增結果；圖B為設計沙門氏菌FWP及RVP的invA基因序列；圖C為沙門氏菌的陽性擴增反應產物測序結果，1～4分別對應圖A中從下至上的1～4條帶；圖B，C中橫線標記部分為正向引物FWP，波浪線標記部分為反向引物RVP的反向互補序列，灰色部分為FWP互補序列上游的一段序列。

2.3 RF-SRCA引物特異性

本研究選擇39株菌株進行特異性分析，擴增曲線結果見圖4中A，14株沙門氏菌擴增曲線明顯起峰，非沙門氏菌無擴增。熔解曲線見圖4中B，14株沙門氏菌在89.20 ℃左右形成單一熔解峰，無引物二聚體和非特異性擴增產生，表明設計的RF-SRCA引物特異性良好。

圖4 引物特異性分析Fig.4 The specificity analysis of primers注：圖A為RF-SRCA特異性分析擴增曲線，NC為陰性對照，1～14為表1中1～14號沙門氏菌，15～39為表1中15～39號非沙門氏菌；圖B為RF-SRCA特異性分析熔解曲線。

2.4 靈敏度結果分析

以1.2.7中梯度稀釋后的模板進行RF-SRCA反應，擴增完成后對其產物進行熔解曲線分析，結果見圖5。模板DNA濃度范圍為60 ng/μL～6 fg/μL時，沙門氏菌擴增曲線(見圖5中A)起峰時間出現梯度遞增，熔解曲線(見圖5中B)為熒光強度遞增的特異性熔解峰。模板DNA濃度為0.6 fg/μL時，擴增曲線無起峰現象，熔解曲線無明顯熔解峰，為陰性結果。因此，RF-SRCA熔解曲線方法檢測沙門氏菌的靈敏度為6 fg/μL。以同樣的模板進行RF-PCR反應，擴增結果見圖6中A和B。當模板DNA濃度范圍為60 ng/μL～600 fg/μL時出現起峰時間梯度的擴增曲線，熔解曲線出現梯度特異性熔解峰。當模板濃度為60 fg/μL時無擴增曲線及特征熔解峰產生。因此，RF-PCR方法檢測沙門氏菌的靈敏度為600 fg/μL。由此可知，RT-SRCA熔解曲線法檢測沙門氏菌的靈敏度比RF-PCR方法靈敏度高100倍。

圖5 RF-SRCA靈敏度分析Fig.5 The sensitivity analysis of RF-SRCA注：圖A為RF-SRCA靈敏度分析擴增曲線，NC為陰性對照，1～9模板濃度為60 ng/μL～0.6 fg/μL；圖B為RF-SRCA靈敏度熔解曲線。

圖6 RF-PCR靈敏度分析Fig.6 The sensitivity analysis of RF-PCR注：圖A為RF-PCR靈敏度擴增曲線，NC為陰性對照，1～9模板濃度為60 ng/μL～0.6 fg/μL；圖B為RF-PCR靈敏度熔解曲線。

2.5 人工污染沙拉醬中沙門氏菌檢出限分析

分別用RF-SRCA和RF-PCR方法檢測人工污染沙拉醬中的沙門氏菌。RF-SRCA結果見圖7中A和B，菌液濃度為4.6×100～4.6×108CFU/g，擴增曲線起峰時間出現梯度遞增，熔解曲線出現熒光信號梯度遞增的特異性熔解峰，當菌液濃度為4.6×10-1CFU/g時無擴增曲線和熔解峰產生。因此，人工污染沙拉醬中沙門氏菌的檢出限為4.6×100CFU/g。PCR方法檢測結果見圖8中A和B，當人工污染樣品中菌液濃度為4.6×102～4.6×108CFU/g，出現陽性擴增，當菌液濃度小于4.6×102CFU/g時未出現陽性擴增。因此，RT-PCR方法檢測污染沙拉醬中沙門氏菌的檢出限為4.6×102CFU/g。由此可知，RF-SRCA熔解曲線法比RT-PCR方法檢出限低100倍。

圖7 RF-SRCA檢出限分析Fig.7 The detection limit analysis of RF-SRCA注：圖A為RF-SRCA檢出限擴增曲線，NC為陰性對照，1～10菌液濃度為4.6×10-1～4.6×108 CFU/g；圖B為RF-SRCA檢出限熔解曲線。

圖8 RF-PCR檢出限分析Fig.8 The detection limit analysis of RF-PCR注：A為RF-PCR檢出限擴增曲線，NC為陰性對照，1～10菌液濃度為4.6×10-1～4.6×108 CFU/g ；B為RF-PCR檢出限熔解曲線。

3 結論

本研究建立了RF-SRCA熔解曲線法檢測復合調味品中沙門氏菌的方法，擴增完成后對產物進行熔解曲線分析，可排除引物二聚體或非特異產物對檢測結果的影響，通過峰形和Tm值驗證了擴增結果的準確性。本研究對沙門氏菌的擴增產物進行熔解曲線分析，結果顯示熔解峰值穩定在一定范圍(Tm值為(89.20±0.08)℃)，無二聚體或非特異產物出現。利用RF-SRCA熔解曲線進行特異性檢測，14株沙門氏菌為陽性，25株非沙門氏菌為陰性，結果表明引物特異性良好。RF-SRCA熔解曲線法檢測沙門氏菌的靈敏度為6 fg/μL，較RF-PCR方法高100倍；人工污染沙拉醬中沙門氏菌的檢出限為4.6×100CFU/g，較RF-PCR方法低100倍。綜上所述，利用RF-SRCA檢測食品中沙門氏菌切實可行，且該方法具有操作簡便、靈敏、高效、結果可直接判定等優點，在食品安全檢測領域具有良好的應用前景。