百會、足三里穴電針預處理對腦缺血/再灌注大鼠腦、腸炎性因子的影響

張繼瑤，唐 強，朱路文*

1 黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040；

2 黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱150001

隨著社會的不斷進步，生活節奏的不斷加快，我國腦卒中發病率呈上升態勢。研究顯示，2017 年我國腦血管病在農村人群疾病死亡比例中占23.18%，在城市人群疾病死亡比例中占20.52%［1］。其中，缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）具有高發病率、高致死率、高致殘率、高復發率及并發癥多的“四高一多”特點，嚴重威脅人類健康，給家庭和社會帶來巨大負擔。目前針對IS 最有效的治療手段是恢復缺血腦組織的血氧供應，但其引發的腦缺血再灌注損傷可導致更加嚴重的腦功能障礙發生，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）［2］。CIRI 不可逆且病理機制復雜，涉及炎癥反應、鈣超載、神經元興奮性氨基酸毒性增強、細胞凋亡、氧自由基損傷等多種途徑，目前臨床上無特效藥物治療［3-4］。因此，如何預防CIRI 的發生至關重要。“圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂”的“治未病”理念對腦卒中預防及治療具有重要指導意義［5］。針灸可激發人體經絡之氣，增強其抗邪與應變能力，通過調節體質，促進健康，減輕相關疾病損害的程度，甚至預防疾病的發生［6］。研究表明，針刺治療IS可擴張腦血管，有效增加腦卒中患者缺血區腦部血流量，改善患者腦組織氧和能量代謝，促進其病后腦功能重塑［7］。電針（electroacupuncture，EA）具有針灸和電療的雙重優點。研究顯示，在腦缺血前給予多次重復的電針預處理，誘導腦缺血耐受，可減輕缺血、缺氧所引發的腦組織損傷［8］。但電針治療腦缺血再灌注損傷機制復雜，目前尚未形成統一共識。研究指出電針預處理防治CIRI 可能涉及多通路、多靶點，如改善腦細胞能量代謝、抑制興奮性氨基酸分泌、降低Ca2+超載損傷、調控氧化應激反應、緩解炎性反應、調控血腦屏障及腦水腫、調控細胞自噬等［9-10］。根據中醫腦腸同治的理論，腦為髓海，元神之府，缺血性中風發生后，神機失用，大腸失司，百會穴為頭部各經脈之氣匯聚處，針刺可醒腦安神、平肝熄風，足三里穴為足陽明胃經合穴，針刺可合治六腑、健脾和胃、扶正培元。臨床防治腦缺血及腦缺血再灌注損傷常選擇百會穴、足三里穴［11-13］。本研究選擇百會穴、足三里穴電針預處理干預CIRI 大鼠，探討EA 預處理對腦缺血/再灌注大鼠前肢抓握力量和腦、腸、外周血中白細胞介素（in?terleukin，IL）-17A、IL-10 表達的影響，探討電針預處理的腦-腸保護作用機制，以期為EA 預處理防治腦缺血/再灌注損傷提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠36只，8～10周齡，體質量220～240 g，采購自遼寧長生生物技術有限公司，合格證號SCXK（遼）2015-0001。SPF級飼養條件：動物自由食水，溫度23～25 ℃，濕度60%～70%，人工光照12 h∶12 h 明暗交替（7∶00～19∶00照明），通風良好，噪音＜60 dB，每2～3 d 更換一次墊料，定期清潔鼠籠和飲水器。本實驗的操作流程遵循2006年科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》以及小動物倫理與保護的相關規定。

1.2 主要實驗試劑與設備

4%多聚甲醛溶液（安徽雷根生物技術有限公司）；二甲苯（天津市富宇精細化工有限公司）；蘇木素（Biosharp）、1%鹽酸乙醇分化液（安徽雷根生物技術有限公司）；Rabbit Anti-IL-17 Polyclonal Anti?body（北京博奧森生物技術有限公司）；IL-10 Poly?clonal antibody（武漢三鷹生物技術有限公司）；RIPA裂解液、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；大鼠IL-17A ELI?SA試劑盒、大鼠IL-10 ELISA試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）；一次性使用無菌針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）；G6805-2A 型低頻電子脈沖治療儀（上海華誼醫用儀器有限公司）；YP5002型電子天平（常州市衡正電子儀器有限公司）；D1008E型掌上離心機（SCILOGEX）、Multiskan FC 型酶標儀（Thermo Fisher Scientific）、ChemiDocTMMP Imaging System、小型垂直電泳轉印系統（Bio-Rad）、Excelsior AS 組織處理機（Thermo Fisher Scientific）、YDS-35 型液氮容器（樂山市東亞機電工貿有限公司）；Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗分組 將36 只大鼠編號，采用Excel 生成隨機數字表（1～12），任意選擇隨機數字表中1個數為起始點對應大鼠編號1，從左至右，自上而下分別對應1～36 號大鼠。用隨機數字除以3 所得余數確定每只大鼠的分組，余數0、1、2 分別對應假手術組（S-con 組）、模型組（M-con 組）和電針組（EP 組），每組12只。

1.3.2模型制備 模型制備前12 h 大鼠禁食不禁水。模型制備過程中所涉及的手術器材及用作線拴的魚線（直徑0.26 mm）均進行高壓滅菌處理或75%酒精浸泡消毒，頭端1 mm 做過蠟處理，從過蠟端算起，在魚線18～22 mm 處用防褪色marker 筆做好標記。除S-con 組外，M-con 組、EP 組參照KOI?ZUMI 等［14］線拴法加以改良，制備大鼠右側大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion/reperfu?sion，MCAO/R）模型，在頸總動脈中插入頭端過蠟的魚線至大腦中動脈起始端，缺血120 min 后拉出栓線尾端恢復灌注。模型制備過程中若出現制備不成功或者大鼠死亡隨即剔除，另選大鼠補充，確保每組12只。

1.3.3干預方法

1.3.3.1S-con組S-con組按類似MCAO/R模型制備方法操作，但不結扎頸總動脈和頸內動脈，不插入線拴，即不阻斷腦血流和再灌注。

1.3.3.2M-con組M-con組按MCAO/R模型制備方法操作，120 min后拔線恢復腦血流灌注。

1.3.3.3EP組參考《實驗動物圖譜》［15］穴位定位，選取大鼠百會穴、患側足三里穴，采用針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司，規格：0.25 mm×13 mm）進行電針預處理。于百會穴由前向后平刺約3 mm，足三里穴直刺6 mm，連接低頻電子脈沖治療儀（上海華誼醫用儀器有限公司，G6805-2A 型），正極接百會穴，負極接足三里穴，選取疏密波，2/15 Hz，1 mA，以大鼠下肢輕微震顫為度，連續刺激30 min，1 次/d，每周連續干預6 d后休息1 d，共干預2周。最后1次電針干預24 h后大鼠接受MCAO/R模型制作，120 min后拔線恢復腦血流灌注。

1.4 觀察指標

1.4.1前肢抓握力量 于術前1 d，再灌注12 h，再灌注1、3、7 d 采用大小鼠抓力測定儀（濟南益延科技發展有限公司，YLS-13A 型）對各組大鼠的前肢抓握力量進行測定。測試者1只手提起待測定大鼠的尾部，將其置于抓力儀測定區域，當測試者向后拉大鼠尾部時，大鼠試圖抓緊抓力測定儀橫桿以免從橫桿脫落，這時測試者繼續向后拖拽大鼠，直至其滑脫，同時測定儀顯示出大鼠此次的前肢抓握力量，每只大鼠測試2次，取最大值作為最后數據。

1.4.2IL-17A、IL-10 含量 再灌注7 d 后，各組隨機選取6 只大鼠麻醉后，用一次性采血針和采血管快速抽取1.5 mL腹主動脈血，室溫下靜置30 min，于離心機上離心（4 000 r/min，10 min，-4 ℃），取上層血清，用于測定IL-17A、IL-10 的含量。將ELISA 試劑盒從冷藏環境中拿到室溫平衡15～30 min；將原倍標準品用稀釋液配置成5 個不同濃度的標準品；加樣后將酶標板置于37 ℃培養箱中溫育30 min；手工洗板完成后每孔加酶標試劑50 μL；再次溫育和手工洗板；每孔加入顯色試劑A、B，各50 μL，顯色10 min；終止后在酶標儀450 nm下測定各孔的吸光度。

1.4.3IL-17A、IL-10 蛋白表達 再灌注7 d 后，各組隨機選取6 只大鼠抽取腹主動脈血后，取缺血側腦組織和結腸組織，采用Western blot檢測缺血側皮層和結腸組織中IL-17A、IL-10蛋白的表達。在每個樣本（約0.05 g）內加入相應體積的裂解液（約500 μL），冰上充分研磨（5 min）；離心，取上清液，進行蛋白定量；制備聚丙烯酰胺凝膠及蛋白上樣液，組裝電泳裝置開始電泳；經轉膜、封閉、洗膜，孵育一抗、二抗、ECL 底物發光后用ChemiDocTMMP Imaging Sys?tem將聚偏氟乙烯（Poly vinylidene fluoride，PVDF）膜進行暗室曝光及掃描膠片，分析目標條帶光密度值。

1.4.4IL-17A、IL-10 平均光密度值 再灌注7 d后，將各組剩余的6只大鼠麻醉后，從心尖快速灌注20 mL 生理鹽水，然后繼續灌注10 mL 的4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液。大鼠軀干發硬后，斷頭取缺血側腦組織，并剪取一定長度的結腸組織，放入4%多聚甲醛溶液中4 ℃冰箱過夜。次日將腦組織和結腸組織取出，以視交叉處為切開點將腦組織行冠狀切開，向后取約6 mm，另取回盲瓣以上的腸段2 cm，進行常規石蠟包埋。采用免疫組化法檢測IL-17A、IL-10 的表達。將組織修塊、脫水、透明、透蠟處理和常規石蠟包埋；切片后烤片，脫蠟至水；將切片放入檸檬酸鈉抗原修復液中修復；在組織表面滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫條件下孵育（10 min）；在組織表面滴加山羊血清，CO2培養箱中孵育（30 min，37 ℃）；一抗孵育，濕盒內過夜（4 ℃）；次日取出切片，CO2培養箱中復溫（40 min，37 ℃）；在組織表面滴加酶標山羊抗兔IgG聚合物，CO2培養箱中孵育（20 min，37 ℃）；在組織表面滴加DAB 工作液（100 μL），待組織顏色剛剛變深時迅速終止反應；蘇木素復染、脫水、透明、封片后顯微鏡（×100）下觀察切片，定位，顯微鏡（×400）下拍照，計算IL-17A、IL-10 免疫陽性反應的平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.4.5缺血側皮層病理改變 將各組用于免疫組化的缺血側腦組織修塊、脫水、包埋、切片、烤片，依次在二甲苯溶液Ⅰ中浸泡（10 min），二甲苯溶液Ⅱ中浸泡（10 min），無水乙醇溶液Ⅰ中浸泡（2 min），無水乙醇溶液Ⅱ中浸泡（2 min），95%乙醇溶液（2 min）、85%乙醇溶液（2 min）中浸泡，蒸餾水中浸泡（2 min），蘇木素染液中浸泡（15 min），蒸餾水中浸泡（5 min），1%鹽酸乙醇分化液中浸泡（1 s），自來水流水沖（20 min），蒸餾水中反藍（2 min），95%乙醇溶液中浸泡（2 min），伊紅染液中浸泡（15 s），脫水、透明、封片，顯微鏡（×400）下拍照。

1.5 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布以（）表示，若方差齊，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊則采用Tamhane's T2 進行檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3組前肢抓握力量比較

與S-con 組比較，M-con 組再灌注12 h，再灌注1、3、7 d 前肢抓握力量均明顯降低（P＜0.05）；與Mcon 組比較，EP 組再灌注12 h，再灌注1、3、7 d 前肢抓握力量均明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 3組前肢抓握力量比較（） gTable 1 Comparison of forelimb grasping strength in three groups（） g

表1 3組前肢抓握力量比較（） gTable 1 Comparison of forelimb grasping strength in three groups（） g

注：與S-con組同時間點比較，1）P＜0.05；與M-con組同時間點比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the S-con group at the same time,1)P<0.05;compared with the M-con group at the same time,2)P<0.05.

2.2 3組腹主動脈血清IL-17A、IL-10含量比較

與S-con 組比較，M-con 組再灌注7 d 后腹主動脈血清IL-17A、IL-10的含量均明顯增加（P＜0.05）；與M-con 組比較，EP 組再灌注7 d 后腹主動脈血清IL-17A的含量明顯減少，IL-10的含量明顯增加（P＜0.05）。見表2。

表2 3組血清IL-17A、IL-10含量比較（）ng/LTable 2 Comparison of content of IL-17A，IL-10 of serum in three groups（） ng/L

表2 3組血清IL-17A、IL-10含量比較（）ng/LTable 2 Comparison of content of IL-17A，IL-10 of serum in three groups（） ng/L

注：與S-con 組比較，1）P＜0.05，與M-con 組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the S-con group,1) P<0.05;compared with the M-con group,2)P<0.05.

2.3 3 組缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10 蛋白表達比較

與S-con 組比較，M-con 組再灌注7 d 后缺血側皮層內、結腸組織中IL-17A、IL-10蛋白表達量均明顯增加（P＜0.05）；與M-con 組比較，EP 組再灌注7 d 后缺血側皮層、結腸組織中IL-17A 蛋白表達量明顯減少，IL-10 蛋白表達量明顯增加（P＜0.05）。見表3、圖1。

圖1 3組缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10蛋白電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of IL-17A,IL-10 protein of ischemic cortex and colon tissue in three groups

表3 3組缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10蛋白表達比較（）Table 3 Comparison of expression of IL-17A，IL-10 protein of ischemic cortex and colon tissue in three groups（）

表3 3組缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10蛋白表達比較（）Table 3 Comparison of expression of IL-17A，IL-10 protein of ischemic cortex and colon tissue in three groups（）

注：與S-con組比較，1）P＜0.05；與M-con組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the S-con group,1)P<0.05;compared with the M-con group,2)P<0.05.

2.4 3 組缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10 的AOD值比較

與S-con 組比較，M-con 組再灌注7 d 后缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10 蛋白的AOD 值均明顯升高（P＜0.05）；與M-con組比較，EP組再灌注7 d后缺血側皮層、結腸組織IL-17A 的AOD 值顯著降低，IL-10 的AOD 值明顯升高（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 3組缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10陽性表達（×400）Figure 2 Positive expression of IL-17A,IL-10 of ischemic cortex and colon tissue in three groups(×400)

表4 3組缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10的AOD值比較（）Table 4 Comparison of AOD value of IL-17A，IL-10 protein of ischemic cortex and colon tissue in three groups（）

表4 3組缺血側皮層、結腸組織IL-17A、IL-10的AOD值比較（）Table 4 Comparison of AOD value of IL-17A，IL-10 protein of ischemic cortex and colon tissue in three groups（）

注：與S-con組比較，1）P＜0.05；與M-con組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the S-con group,1)P<0.05;compared with the M-con group,2)P<0.05.

2.5 3組缺血側皮層病理變化

S-con 組再灌注7 d 后右側腦組織未見病理改變；M-con組再灌注7 d后缺血側皮層腦細胞排列紊亂、皺縮，片狀壞死，核固縮、邊移、深染，形態不規則，神經纖維空泡化。與M-con 組比較，EP 組再灌注7 d 后缺血側皮層細胞壞死的數量明顯減少，神經纖維空泡化等病理改變明顯減輕。見圖3。

圖3 3組缺血側皮層病理變化圖（×400）Figure 3 Pathology figure of ischemic cortex in three groups(×400)

3 討論

MURRY 等［16］于1986 年提出缺血預適應（isch?emic preconditioning，IPC）的概念，預先給予短暫性且非致死性的輕度缺血或再灌注刺激可增強機體對隨后發生的長時間致死性缺血的耐受。KITAGAWA等［17］證實1次或多次短暫的亞致死性IPC，可在一定時間內增強腦組織對嚴重缺血刺激的耐受。此外，越來越多的臨床證據表明，很多預適應方式（如局部或遠程缺血、缺氧、內毒素、細胞因子和麻醉藥等）都能夠誘導腦保護機制和心臟保護機制，對抗缺血/再灌注損傷［18-19］。但從臨床實際應用情況來看，上述預處理方法仍有一定的局限性，特別是對于危重癥患者仍存在尚未解決的矛盾。為此，本研究采用電針預處理干預CIRI 大鼠模型，以期為IPC在臨床的應用提供參考。

3.1 電針預處理能夠減輕腦缺血/再灌注大鼠的運動功能障礙

本研究結果顯示，M-con 組、EP 組術后各時間點前肢抓握力量均低于S-con 組，EP 組術后各時間點前肢抓握力量均明顯高于M-con 組，這提示腦缺血能夠造成大鼠的運動功能障礙，而電針預處理能夠減輕腦缺血/再灌注大鼠的運動功能障礙。這可能與以下因素有關：①EA預處理能產生類IPC的作用，能夠在哺乳動物的大腦中產生快速型和延遲型神經保護作用。研究顯示，電針百會、足三里等穴位可通過促進缺血側運動皮層M2 型小膠質細胞外泌體的分泌，改善大鼠腦缺血后的神經功能缺損癥狀及運動功能障礙［20］。腦缺血再灌注后，神經細胞大量死亡，大鼠有神經功能的異常以及運動行為學改變，針刺足三里等穴位能夠保護腦神經細胞再生，促進其肢體運動功能的恢復［21］。②中風的病機多本虛標實，針刺應通經絡、行氣血、開腦竅，百會穴位于顛頂，多條經脈交匯于此，針刺百會可醒腦開竅、通達陰陽脈絡；足三里穴為足陽明胃經的要穴，足陽明胃經多氣多血，主潤宗筋，針刺足三里穴可治療中風后肢體不利［12，22-23］。電針刺激百會穴、足三里等穴位可提高CA3 區神經生長相關蛋白43和突觸素在海馬區的表達，保護缺血性腦損傷，促進CIRI 后損傷區域突觸的重建和功能的重塑［24］。電針足三里等穴位的神經保護作用有明顯促進局灶性CIRI大鼠缺血周圍皮質紋狀體區vimentin的增殖，促進缺血周圍區皮質以及缺血側室管膜下區內源性神經干細胞的增殖，減少腦梗死體積，改善動物整體行為學、神經功能缺損及運動功能［25-26］。這與WANG 等［27］研究顯示，電針能夠對局灶性腦缺血刺激誘導產生雙相的耐受，快速型保護效應發生在EA 預處理后2 h，而延遲型保護效應發生在EA 預處理后24 h 的結果相似，也和WANG 等［28］對輕癥患者或健康人預先實施針刺療法可激發人體正氣，增強其抗病能力，預防和減少后續疾病發生發展的觀點吻合。

3.2 電針預處理可減輕腦缺血后腸道-中樞炎癥反應和免疫損傷

本研究結果顯示，與S-con 組比較，M-con 組再灌注7 d后腹主動脈血清IL-17A、IL-10的含量均明顯升高，缺血側皮層、結腸組織中IL-17A、IL-10 蛋白表達量和AOD 值均明顯升高；與M-con 組比較，EP 組再灌注7 d 后腹主動脈血清IL-17A 的含量明顯減少，IL-10 的含量顯著增加，缺血側皮層、結腸組織中IL-17A 蛋白表達量和AOD 值均明顯減少，IL-10 蛋白表達量和AOD 值均明顯增加。這提示，腦缺血/再灌注后外周炎癥反應增強，電針預處理可下調腦組織、腸道組織及外周IL-17A 的表達，上調IL-10 的表達，減輕腦缺血后腸道-中樞炎癥損傷。這可能與以下因素有關：①炎癥反應是CIRI的關鍵病理過程。CIRI 發生后，IL-6、IL-1β 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等大量促炎因子分泌并促進中性粒細胞和巨噬細胞向受損組織浸潤，引起炎癥反應惡性循環［29］。Janus 激酶-信號轉導與轉錄激活子信號通路以及核因子κB（nucle?ar factor-kappa B，NF-κB）這2 種信號通路可通過多種細胞因子參與炎癥反應，加重腦損傷［30］。EA 預處理可下調大鼠炎癥因子IL-1β、IL-6、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、NF-κB 表達，調節腦缺血/再灌注后炎癥反應，誘導腦缺血耐受［31-33］。EA預處理可通過減輕缺血側腦組織的神經炎癥反應有效改善腦缺血再灌注損傷，如上調大腦皮層半暗帶Yes 相關蛋白表達，下調神經元NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 的表達等［34-35］。②Th17 細胞分泌的炎性因子IL-17A可增加多種促炎癥因子、趨化因子、黏附分子的表達，促進免疫炎癥反應，破壞血腦屏障，加重腦組織損傷［36-38］。當大鼠腦缺血發生后，腸道內的IL-17+γδT 可增多并遷移至腦組織沉積，EA 預處理可抑制TNF-α、IL-6 等促炎因子的合成和分泌，促使腸道內IL-17A 含量下降，調節T淋巴和B 淋巴細胞的增殖，抑制炎癥反應和免疫損傷，促進腦梗死面積明顯縮小［39-40］。此外，EA 預處理還可以激活大鼠體內多種免疫細胞分泌抗炎因子IL-10，有效減輕炎癥反應，這與徐磊等［41-42］研究結果相似。

4 小 結

百會穴、足三里穴電針預處理可減輕缺血側皮層的病理損傷程度、腸道-中樞炎癥損傷，改善神經行為學功能。但是目前電針預處理干預腦缺血/再灌注大鼠是如何發揮腦-腸保護作用的具體機制尚未完全闡明，未來可基于以上研究進一步深入探討電針預處理的作用機制，為腦缺血/再灌注損傷的預防和治療提供新思路。