基于網絡藥理學及分子對接探討黃連治療2型糖尿病的作用機制

劉慧玲，譚定英，黃 敏，陳平平，張 望

1 廣州中醫藥大學醫學信息工程學院，廣東廣州 510006；

2 廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東廣州540120

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，據調查數據顯示：我國20 歲以上的人群患病率為9.7%［1］。糖尿病及其并發癥對人體有極大的傷害，目前關于糖尿病并發癥的研究主要集中在糖尿病心血管病變、糖尿病視網膜病變、糖尿病自主神經病變和糖尿病腎病［2］。中醫學認為，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）及其并發癥的病因病機為濕熱內盛、陰虛燥熱、痰瘀阻絡［3］，治療以清熱燥濕、養陰清熱、化痰通絡為主。中藥具有“多成分-多靶點-多通路”的特點，目前廣泛應用于糖尿病的治療，且臨床療效顯著［4］。黃連具有清熱燥濕功效，能有效改善2型糖尿病患者臨床癥狀，降低血糖，療效肯定。但是，目前對黃連治療2型糖尿病的具體藥效基礎及作用機制尚未明確［5］。為此，本研究通過網絡藥理學及分子對接篩選黃連的活性成分及作用靶點，探討其治療2型糖尿病多成分-多靶點-多通路的藥理學作用機制，以期為黃連治療2型糖尿病提供依據。

1 資料與方法

1.1 黃連活性成分篩選與靶點預測

以“黃連”為關鍵詞，利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems phar?macology database and analysis platform，TCMSP）、UniProt 蛋白質數據庫，設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件［6-7］，獲取黃連的活性成分，并從TCMSP數據庫中篩選出對應的靶點。

1.2 2型糖尿病相關基因及黃連潛在作用靶點預測

以“type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞，在毒性與基因比較數據庫（comparative toxicogenomics database，CTD）檢索疾病相關基因，去掉重復靶點，并使用韋恩圖獲取黃連活性成分及2型糖尿病疾病的共同靶點，即為黃連作用于2型糖尿病的潛在作用靶點。

1.3 黃連-活性成分-潛在作用靶點網絡構建

采用Cytoscape 3.6.1 軟件將黃連活性成分與潛在作用靶點導入，構建“黃連-活性成分-潛在作用靶點”網絡，并使用Network Analyzer 插件進行網絡拓撲分析，得出黃連作用于2 型糖尿病的主要潛在靶點。

1.4 構建蛋白質相互作用網絡

將共同靶點導入STRING 分析平臺，構建黃連治療2 型糖尿病的蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡。設定研究物種為“Homo sapiens”，蛋白相互作用閾值（medium confidence）＞0.900［8］，選擇K-means聚類分析，并將分析結果導入Cytoscape3.6.1軟件中進行拓撲分析，得出黃連作用于2 型糖尿病的核心靶點。

1.5 生物信息學分析

采用DAVID 和Hiplot 科研數據可視化平臺對黃連治療2 型糖尿病的20 個核心靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and ge?nomes，KEGG）信號通路分析，設定P＜0.01，并分析治療2型糖尿病的主要通路。

1.6 分子對接

選擇PPI 拓撲分析篩選所得的核心靶基因及其對應的活性成分進行半柔性分子對接，利用Pub?Chem 數據庫得到黃連活性成分的2D 結構信息，用ChemBio3D Ultra 14.0.0.117 軟件轉換為3D 結構并優化最小自由能，使用PDB 數據庫查找靶蛋白，利用AutoDockTools 1.5.6 軟件分別對小分子（活性成分）和對接受體（靶蛋白）進行預處理，包括刪去靶蛋白晶體結構中的配體分子和水分子，加氫、加電荷、賦予原子類型。結合位點定義及格點參數計算，設置構象搜索方法與對接參數并輸出dpf 格式文件，進行分子對接計算，獲得黃連的活性分子與靶蛋白的對接結果，將50個構象按能量排序查看結果，存儲最優構象即結合能最小的構象。利用Py?MOL 2.4.1打開查看對接圖像，繪制靶蛋白與小分子相互作用圖，觀察其結合模式以及與周邊氨基酸殘基的相互作用。活性成分與靶蛋白之間相互作用強度大小可用對接分數表示，該數值為負數提示該活性成分能與靶標自由結合，數值越小表示結合度越好。一般認為當結合親和力（binding affinity）＜-7.0 kcal/mol（1 kca/mol＝4.186 kJ/mol）時說明活性分子與靶蛋白有強烈的結合活性［9］。

1.7 引用和參考的數據庫

見表1。

表1 參考數據庫Table 1 Collections of database

2 結果

2.1 黃連活性成分及其靶點預測結果

根據篩選條件OB≥30%、DL≥0.18 從TCMSP 數據庫篩選出黃連活性成分14 種，見表2。通過TC?MSP 中的Related Targets 進行篩選、刪除重復項，獲得黃連對應的有效靶點189 個，并利用UniProt 蛋白質數據庫進行匹配，得到對應的靶點基因。

表2 黃連活性成分Table 2 Active ingredients of Coptis chinensis

2.2 獲取黃連的潛在作用靶點

以“type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞，在CTD數據庫進行基因檢索，檢索到與T2DM 相關的疾病基因有9 813 個，利用韋恩分析，得出黃連治療T2DM的潛在作用靶點136個。篩選出小檗堿、槲皮素、氫化小檗堿等主要活性成分對應的靶點見表3。

表3 黃連主要活性成分及其對應靶點Table 3 Main active ingredients and corresponding targets of Coptis chinensis

2.3 黃連-活性成分-潛在作用靶點網絡

黃連-活性成分-潛在作用靶點網絡見圖1。其中，綠色節點即為黃連，黃色節點為黃連的各活性成分，其余藍色節點為活性成分對應的潛在作用靶點，體現中藥“多成分-多靶點”的特點。該網絡由151 個節點，146 條邊構成，平均度值（degree）為2.04。以各節點的度值（degree）大小進行排序，在網絡中活性成分的度值較高則可能為核心節點。如槲皮素（degree＝102）、氫化小檗堿（degree＝16）、小檗堿（degree＝13）、小檗浸堿（degree＝4）、巴馬汀（degree＝4），這些可能是黃連發揮藥效的主要活性成分。而靶點度值較高NOS2（degree＝2），PTGS2（de?gree＝2）、RXRA（degree＝2）、ADRA1D（degree＝2），則可能為黃連治療2 型糖尿病的主要潛在作用靶點。

圖1 黃連-活性成分-潛在作用靶點網絡Figure 1 Coptis chinensis-active ingredient-potential target network

2.4 黃連治療2型糖尿病的潛在作用靶點PPI網絡分析

將黃連的潛在作用靶點導入STRING 平臺構建PPI 網絡，設置高置信度（high confidence<0.900>），隱藏無連接的靶點，見圖2。

圖2 蛋白質相互作用（PPI）網絡Figure 2 Protein interaction(PPI)network

STRING 根據與其相互作用的score值對顏色進行映射。不同顏色的邊代表不同相互作用類型，紫色的邊表示2 個節點之間的聯系已通過實驗驗證（experimentally determined），綠色代表基因相鄰（gene neighborhood），紅色代表基因融合（gene fusions），深藍色代表著基因共現（gene co-occurrence），淡藍色則表示二者蛋白質同源（protein homology）。將所得PPI數據導入Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化分析，該PPI網絡包含有136個節點，415 條邊，經Network An?alyzer 拓撲分析后，以各靶點的度值（degree）大小進行排序，前20 名的基因見表4。由此預測前20個靶點可能是黃連治療2型糖尿病的核心靶點。

表4 作用靶點的拓撲學分析結果（度值排名前20）Table 4 Topological analysis results of action targets（top 20 in degree value ranking）

2.5 黃連治療2型糖尿病的GO富集分析

對黃連作用于2 型糖尿病的20 個核心靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析。富集分析后共獲得2 485 個條目，其中，生物過程（biological process，BP）有2 243個、分子功能（molec?ular function，MF）有152 個、細胞組成（cellular com?ponents，CC）共有90 個，見圖3。在BP 方面主要涉及腺發育、上皮細胞增殖、DNA 結合轉錄因子活性的調節、氧化應激及對脂多糖等多種細胞凋亡反應。在MF 方面主要涉及DNA 轉錄因子結合、酶結合、受體結合等。在CC 方面主要涉及酶調節復合物、囊腔、膜筏、膜微區、膜區的構成。由此表明，黃連可調控多種生物反應參與治療2型糖尿病。

圖3 GO富集分析結果Figure 3 GO enrichment analysis results

2.6 黃連治療2型糖尿病的KEGG通路富集分析

采用DAVID、Hiplot 數據庫對20 個核心靶點進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，設定生物信息通路P＜0.01，KEGG 通路富集共得到187 條通路，其中具有顯著意義的有137條，按通路中含有的基因數量進行排序，前20 條顯著通路信息見表5。黃連參與調控2型糖尿病主要有MAPK、糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）-RAGE、PI3K-Akt、Toll 樣受體、HIF-1 及TNF 信號通路，參與調控的基因靶點主要有絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤抗原p53（TP53）、轉錄因子AP-1（JUN）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL-6）等。一條通路含有多個靶點，一個靶點也參與了多條通路，這表明黃連治療2 型糖尿病可能與其“多靶點-多通路”的作用機制有關。

表5 黃連治療2型糖尿病的KEGG通路信息Table 5 KEGG pathway information of Coptis chinensis in the treatment of type 2 diabetes

2.7 分子對接及結合自由能分析

本研究選取黃連作用于2 型糖尿病的20 個核心靶點與黃連的2 個有效成分進行分子對接，以驗證黃連活性成分與靶點的對應關系，通過結合自由能判斷分子間的結合能力。結果顯示，20 組對接結果的結合能均＜-7 kcal/mol。見表6、圖4。

圖4 分子對接三維圖Figure 4 Three dimensional view of molecular docking

表6 分子對接結果Table 6 Results of molecular docking

3 討論

本研究使用網絡藥理學的研究方法，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 篩選出小檗堿、槲皮素等14 種活性成分，對應189 個有效靶點。通過建立“黃連-活性成分-潛在作用靶點”網絡，根據各活性成分的degree值，排序較前的活性成分主要有槲皮素、氫化小檗堿、小檗堿等。槲皮素藥理活性廣泛，具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂等藥理學作用多種生物活性［10］，可能在預防和治療糖尿病中發揮作用。小檗堿具有抗菌、抗病毒、降血糖、降脂、改善胰島素抵抗、調節慢性炎癥、抗微生物等藥理學作用［11-12］。分子對接結果顯示，小檗堿、槲皮素與靶基因具有良好的結合作用，提示本次所篩選出的黃連主要活性成分，其治療2 型糖尿病具有一定的藥理學基礎。

本研究PPI網絡分析結果顯示，黃連治療2型糖尿病的作用核心靶點主要有MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6。分子對接結果顯示，黃連的主要活性成分和靶點之間的結合構型具有強烈的活性，如槲皮素與EGF、IL-1β、TNF、MAPK1、IL-6 等蛋白形成較好的對接模式與較高親和力。這提示這些核心靶點均可能是黃連治療T2DM 的潛在作用靶點。KEGG 通路富集分析顯示，參與調控主要通路有MAPK、AGEs-RAGE、PI3K-Akt、Toll樣受體、HIF-1、TNF等信號通路。每個基因靶點作用于多條信號通路，推測黃連是通過調控以上靶點來發揮治療2 型糖尿病的作用。綜合GO 功能與KEGG 通路富集分析結果，提示黃連治療2 型糖尿病是一個相對復雜的作用機制。這可能與以下因素有關。

3.1 調控糖脂代謝

在KEGG 通路富集分析中，MAPK 信號通路的顯著性最高，富集了14 個基因靶點數。MAPK 為生物能量代謝調節的關鍵分子，可調節機體糖、脂代謝。在高糖狀態下，由多種因素激活MAPK 信號轉導通路，參與機體糖脂代謝的調控［13］。有氧運動可以抑制或減輕機體胰島素抵抗發生，而MAPK 可能是有氧運動抑制或改善胰島素抵抗的另一重要因子［14］。小檗堿可以通過改善氧化應激，在一定程度上增加胰島素的表達以及β 細胞的再生，激活各種組織如脂肪、肌肉中的MAPK信號通路，從而降低血糖水平［15］。PI3K-Akt 信號通路是胰島素信號轉導的主要途徑，在糖脂代謝中扮演重要角色，其可通過介導生長因子，從而對葡萄糖穩態和脂質代謝起調控作用［16］。這提示，黃連治療2 型糖尿病可能與調控糖脂代謝有關。

3.2 調控炎癥反應

2 型糖尿病是自然免疫和先天性疾病，是一種慢性低度炎癥狀態，炎癥是誘發2 型糖尿病的重要因素之一。本研究富集分析結果顯示，黃連可通過調控多個生長因子（EGFR、VEGFA、TNF 等）及炎癥因子（IL-6、IL-1β），參與調控MAPK、Toll 樣受體、TNF 等信號通路。TNF-α 是一類能造成腫瘤細胞死亡的細胞因子，具有廣泛的生物學效應，其能夠介導MAPK 信號通路，促進IL-1、IL-6、CRP 等多種促炎介質的產生，從而啟動炎癥級聯反應［17］。Toll樣受體為機體免疫防御系統的重要一環，其可通過對病原相關分子模式識別來調節免疫應答與炎癥反應，對T2DM 患者的炎性反應、胰島素抵抗有明顯的調控效果［18］。本研究認為黃連的作用靶點主要為MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6，其有效成分小檗堿可能通過參與MAPK、Toll 樣受體等信號通路的調控而抑制慢性炎癥，進而緩解異常代謝和胰島素抵抗，這與操映倩等［19］研究結果一致，但其認為小檗堿是與Hsp90b1、Pdia6、Prdx5、Pdia4、Itgam、PTGS1、NOS2、IL-10 等靶點相互作用，從而調控炎癥反應的觀點與本研究結果存在一定差異。

3.3 調控細胞增殖與凋亡

AGEs-RAGE 通路可調控胰島細胞凋亡、功能受損的過程。本研究KEGG 通路富集分析顯示，AGEs-RAGE 信號通路富集了MAPK1、AKT1、JUN、TNF、IL-6 等11 個基因靶點，是顯著性較高的通路。當AGEs 水平升高時，可通過上調胰島細胞表面RAGE 受體表達，激活氧化酶而使核因子κB（NFκB）表達增高，從而導致胰島細胞凋亡［20］。PI3KAkt 信號通路也是機體內細胞增殖、分化、凋亡的重要信號通路，可對糖尿病血管并發癥的發生發展發揮調控作用。本研究顯示，小檗堿可通過調控PI3KAkt 信號通路，抑制細胞增殖，從而影響糖尿病血管病變，與朱昌國等［21］研究結果相似。

3.4 促進氧化應激

氧化應激貫穿于糖尿病并發癥發病機制的始終。糖尿病患者糖基化終產物（AGEs）升高，與受體結合后促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，產生氧自由基，細胞膜發生超氧化，使維持離子狀態的膜蛋白功能受損，最終導致細胞結構、功能、代謝異常，誘發氧化應激反應［22］。HIF-1α 作為調節細胞內氧代謝的關鍵因子之一，是目前發現的唯一能在特異性缺氧狀態下發揮活性的轉錄因子，對糖尿病及其并發癥的發生、發展起促進作用［2］。本研究KEGG 通路富集分析顯示，HIF-1 信號通路在GO 分析中的BP 環節準確度較高，富集了TNF、MAPK1 等9 個基因靶點。而黃連有效成分可作用于上述基因靶點，調控HIF-1信號通路，從而調節機體氧化應激反應，達到治療糖尿病及其并發癥的目的。

4 結語

本研究從網絡藥理學和分子對接角度證實黃連治療2 型糖尿病是一個相對復雜的過程，其主要活性成分為槲皮素、小檗堿等，可能通過作用于MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6 等相關靶點，參與調控MAPK、AGEs-RAGE、PI3K-Akt、Toll 樣受體、HIF-1、TNF 信號通路，通過調控糖脂代謝及炎癥反應、調控細胞增殖與凋亡、促進氧化應激等多方面以發揮治療2型糖尿病及其并發癥的作用。但本研究仍存在一些不足之處，如僅預測定制藥物化學成分作用靶點，沒有對靶點進行上調和下調的預測，未能預測功能改變的方向。下一步將通過實驗驗證網絡藥理學篩選出來的黃連主要活性成分與關鍵靶點的級聯效應，為黃連治療2 型糖尿病提供進一步依據。