電針對血管性認知障礙大鼠海馬功能活動及其分子表達譜的影響

王澤宇，丁妍怡，戴雅玲，楊敏光，黃 佳，張勝行，3*

1 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海 200025；

2 福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州 350122；

3 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院，福建福州350025

血管性認知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是由腦血管病變及其危險因素導致的腦組織缺血缺氧或組織損傷等誘發的認知障礙綜合征［1］。研究顯示，阿爾茨海默病是癡呆的首要病因，血管性因素是癡呆的次要病因，但2019 年《美國心臟病學會雜志》研究報道顯示，在東亞地區血管性因素是癡呆的主要病因［2］。血管性認知障礙在中醫學中屬于“癡呆”范疇，其病位在腦。《素問·脈要精微論》言：“頭者，精明之腑。”頭為諸陽，腦為元神之府，諸陽經皆上頭與腦發生直接或間接的聯系，與臟腑經絡關系密切［3］。因此，針刺頭穴可加強經脈之間的聯系，激發經氣，疏通經絡，調整全身臟腑氣血。研究證實，針刺“神庭”“百會”可激活認知功能相關腦區，包括額葉、顳葉、扣帶回和海馬等腦區，其中學習記憶功能改變與海馬緊密相關［4-5］。學習和記憶、日常生活中的短期記憶都儲存在海馬體中，當海馬區受損時會導致健忘。研究發現，針刺可以改善海馬神經元損傷，在腦缺血中發揮神經保護作用［6］。針刺百會穴可顯著增強腦缺血大鼠的海馬神經元密度，改善其突觸可塑性，進而改善認知行為。因此，針刺治療VCI 很可能是通過改善海馬功能實現的［7］。本研究采用小動物磁共振成像探討電針“百會”“神庭”穴干預VCI大鼠海馬功能活動情況，并利用Agilent mRNA 表達譜芯片分析電針調控的關鍵效應分子及其作用途徑，以期為探究電針治療血管性認知障礙可能的作用機制提供可借鑒的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選擇雄性SPF 級SD 大鼠24 只，體質量（280±30）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供［生產許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005］，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心［許可證號：SYXK（閩）2020-0002］。采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、電針組，每組8 只。本實驗方案經福建中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（批準號：FJTCM IACUC 2019036）。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型制備 采用雙側頸總動脈結扎法制備VCI大鼠模型［8］。模型組、電針組大鼠術前均禁食24 h，用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）進行腹腔注射麻醉；分離左、右側頸總動脈，采用不可吸收外科手術線結扎頸總動脈；手術后腹腔注射20 萬U/mL青霉素鈉溶液（0.05 mL/100 g）。假手術組大鼠僅分離雙側頸總動脈但不結扎。所有大鼠術后放置于26 ℃室溫下等待其自然蘇醒后再放回籠中飼養。

1.2.2干預方法 電針組大鼠術后第14 天，參考《實驗針灸學》的方法選取大鼠百會、神庭穴進行電針干預。參數如下：疏密波，頻率1/20 Hz，刺激強度1，電針干預30 min/次，1次/d，共干預28 d。假手術組、模型組大鼠每日同等抓取，但不進行其他干預。

1.3 觀察指標

1.3.1空間學習記憶能力 采用Barnes 迷宮測試評價大鼠空間學習記憶能力。Barnes迷宮測試主要分為適應階段、學習階段、測試階段3 個階段［9］。在每次實驗前用75%的消毒酒精擦拭平臺、逃避盒各1遍，去除殘留氣味，并將第1層平臺旋轉，避免大鼠因為味道而找到逃避盒。記錄逃避潛伏期、目標象限持續時間百分比。

1.3.2空間工作記憶能力 采用Y迷宮測試評價大鼠空間工作記憶能力。實驗開始時將大鼠置于Y迷宮中央區域，讓其在Y 迷宮中自由探索8 min，并記錄其進入各臂的順序，只有連續進入3 個不同的臂時計為1次正確的交替探索，待8 min結束后將實驗動物拿出Y迷宮，并放回原籠飼養；然后將Y迷宮用消毒酒精擦拭1 遍，以去除殘留氣味的影響。交替率計算方法：Y 迷宮交替率＝正確交替次數/（總交替次數－2）×100%。

1.3.3腦區功能活動分析 采用小動物磁共振掃描儀（德國Bruker，7.0 T）對各組大鼠進行BOLDfMRI掃描。BOLD-fMRI掃描參數如下：回波時間＝28 ms，重復時間＝2 000 ms，視野大小＝32 mm×32 mm，重復次數＝1，圖像矩陣大小＝128×128，層數＝21，層厚＝1 mm，no slice gap，時間點＝200，掃描時間＝6 min。

采用靜息態功能磁共振數據處理助手軟件包（Data Processing Assistant for Resting-State fMRI，DPARSF）和統計參數圖（Statistical Parametric Map?ping，SPM）進行腦區局部一致性分析，數據處理包括去除前10個時間點、時間校正、頭動校正、空間標準化、去線性漂移、濾波（0.01～0.1 Hz）、局部一致性（regional homogeneity，ReHo）值的計算和平滑處理。采用單因素方差分析進行各組大鼠腦區局部一致性變化比較。P＜0.005，clusters＞10 為差異具有統計學意義。

1.3.4基因表達譜分析 每組選擇4 只大鼠提取左、右側海馬總RNA，采用Agilent mRNA 表達譜芯片分析海馬差異mRNA 表達譜，包括體外擴增、熒光標記、芯片雜交和數據預處理分析以及Gene?Spring GX 軟件計算基因表達差異分析，每個數據進行歸一化和質控分析，采用Cluster 3.0 軟件進行聚類分析和Circos圖形化展示差異表達基因。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。數據服從正態分布采用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法進行分析。P＜0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組空間學習記憶能力比較

Barnes 迷宮空間探索試驗結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯更高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組逃避潛伏期明顯更低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組大鼠目標象限持續時間百分比明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組目標象限持續時間百分比明顯增加（P＜0.05）。見表1～2。

表1 3組Barnes實驗逃避潛伏期比較（） 秒Table1 Comparison of latency in Barnes maze in three groups（） s

表1 3組Barnes實驗逃避潛伏期比較（） 秒Table1 Comparison of latency in Barnes maze in three groups（） s

注：與假手術組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

表2 3組目標象限持續時間百分比比較（） %Table2 Comparison of the percentage of duration in the target quadrant in three group（） %

表2 3組目標象限持續時間百分比比較（） %Table2 Comparison of the percentage of duration in the target quadrant in three group（） %

注：與假手術組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;com?pared with the model group,2)P<0.05.

2.2 3組空間工作記憶能力比較

Y 迷宮測試結果顯示，與假手術組比較，模型組Y 迷宮交替率明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，電針組Y 迷宮交替率明顯升高（P＜0.05）。這表明電針百會、神庭穴可以提升VCI 大鼠的Y 迷宮交替率，改善VCI大鼠空間工作記憶能力。見表3。

表3 3組干預后Y迷宮交替率比較（） %Table3 Comparison of the alternation rate of Y-maze after intervention in three groups（） %

表3 3組干預后Y迷宮交替率比較（） %Table3 Comparison of the alternation rate of Y-maze after intervention in three groups（） %

注：與假手術組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;com?pared with the model group,2)P<0.05.

2.3 3組海馬局部一致性比較

研究結果顯示，與假手術組比較，模型組雙側海馬、前額葉、紋狀體及丘腦背外側核等腦區的局部一致性明顯減弱（P＜0.005）；與模型組比較，電針組雙側前額葉、海馬及梨狀皮層腦區的局部一致性明顯增強（P＜0.005）。見表4、圖1～2。

圖1 模型組與假手術組腦區局部一致性比較Figure 1 Comparison of ReHo of brain regions between the model group and the sham operation group

表4 3組ReHo值比較Table4 Comparison of ReHo in three groups

圖2 電針組與模型組腦區局部一致性比較Figure 2 Comparison of ReHo of brain regions between the electroacupuncture group and the model group

2.4 3組海馬基因表達譜分析

海馬組織基因表達譜芯片分析結果顯示，與假手術組比較，模型組海馬mRNA 差異表達＞2 倍的基因共705 個（P＜0.05），其中195 個基因（Sytl1、Chrna7、Gprc5a、Trpv6、Klhl14、Npsr1、Myh3、Galnt3、Nr4a1、Bmp3、Egr2等突觸結構蛋白、乙酰膽堿受體、早期即刻基因相關分子）表達下調；510 個基因（In?sl6、Efcab1、Akr1b1、Tagln、Glrb、Akr1c13、Kcne1L、Ubap1 等炎癥、氧化應激、趨化因子、自噬、凋亡、泛素化相關分子）表達上調。與模型組比較，電針組海馬mRNA差異表達＞2倍共399個基因（P＜0.05），其中166 個基因（Klhl14、Bmp3、Npsr1、Cacna1e 等鈣通道蛋白、能量代謝、免疫調節相關分子）表達上調；233個基因（Insl6、Ube2k、Cdkn1c、Camp、Upk1b等炎癥、細胞周期抑制、泛素化相關分子）表達下調。見圖3～5、表5。

表5 2組比較部分差異mRNA表達結果Table 5 Differential mRNA expression results in the pair?wise comparison

圖3 3組海馬mRNA差異表達的聚類分析Figure 3 Cluster analysis of differential expression of hippocampal mRNA in three groups

3 討論

血管性認知障礙多發于60歲以上老年人群，其發病率高達24.2%［10］。尋找治療血管性認知障礙的適宜治療方案是當前的研究熱點。針灸作為血管性認知障礙的一種行之有效的康復方法，朱永磊等［11］采用“從督論治”針刺法治療腦卒中后認知功能障礙40例，發現“從督論治”針刺可顯著提高簡易精神狀態評分。本研究團隊前期研究提出“臟腑為用、督脈為樞”促進認知功能恢復的中醫康復理論，結合中醫古籍梳理，提出了“通督調神”針刺“百會”“神庭”穴作為治療認知障礙的針刺康復方案，經臨床隨機對照試驗證實，“通督調神”針刺“百會”“神庭”穴可改善血管性認知障礙患者整體認知功能和記憶功能［12-13］。

3.1 電針可以改善VCI大鼠認知功能障礙

圖4 模型組與假手術組海馬mRNA差異表達情況Figure 4 Differential expression of hippocampal mRNA in the model group compared with the sham op?eration group

圖5 電針組與模型組海馬mRNA差異表達情況Figure 5 Differential expression of hippocampal mRNA in the electroacupuncture group compared with the model group

血管性認知障礙會導致多種類型的認知功能受損，主要集中于學習記憶功能及工作記憶功能受損［14-16］。本研究通過對VCI大鼠進行認知功能行為學的檢測，發現VCI 大鼠在Barnes 迷宮實驗中逃避潛伏期上升，隨后的空間探索實驗中，VCI大鼠搜尋逃避盒的軌跡雜亂無章，無法明確定位逃避盒所在的象限，而在Y 迷宮測試中，VCI 大鼠交替率顯著下降，表明VCI 大鼠出現空間學習記憶與工作記憶功能障礙，這與其他研究結果類似［15，17］。電針刺激百會、神庭穴后，VCI大鼠在Barnes 迷宮的逃避潛伏期明顯下降，其探索逃避盒所在區域的停留時間也明顯升高，這提示電針百會、神庭穴可以改善VCI大鼠的空間學習記憶功能；此外，本研究Y迷宮交替率測試也發現電針百會、神庭穴可以改善VCI 大鼠空間工作記憶功能，與前期研究相一致［18］。目前大部分關于電針改善VCI大鼠認知功能障礙的研究認為其可能的機制在于調控相關腦區的蛋白質表達進而改善認知功能［7-8］，而未對電針調控蛋白質改變后相關腦區功能活動的變化進行更深入的探索。因此，本研究擬利用BOLD-fMRI 技術進一步揭示電針干預后VCI大鼠腦區功能活動的直接變化。

3.2 電針可以調控VCI大鼠腦區功能活動

局部一致性信號的強弱作為腦區功能活動高低的敏感性指標之一，檢測腦區血流信號在時間序列上的一致性，通過腦部的血流信號可以間接反映神經元活動的強弱［19］。本研究結果顯示，大鼠雙側頸總動脈結扎42 d 后，其雙側海馬、前額葉、紋狀體及丘腦背外側核均出現腦區活動局部一致性信號下降，這提示模型組大鼠在前額葉、海馬、紋狀體及丘腦背外側核均出現了神經元活動減弱，這些腦區神經元活動性的降低可能是VCI大鼠認知功能下降的重要因素，與NATION 等［20-21］研究結果相似。而電針干預后海馬、前額葉、杏仁核及梨狀皮層均出現局部一致性信號上升，表明電針可以有效增強海馬、前額葉及梨狀皮層等腦區神經元活動，恢復由全腦低灌注導致的神經元功能缺損。海馬是調節記憶編碼和儲存的關鍵腦區，海馬內含有一類可以根據動物在環境中特定位置而放電的位置細胞［22］。腹側、背側海馬與前額葉皮層神經活動可以誘發theta 同步振蕩，從而調節空間記憶任務［23］。海馬-前額葉神經環路參與了學習記憶與工作記憶功能的調控，其具體調控可能與該環路的亞區以及細胞類型有關［24-25］。本研究BOLD-fMRI 結果提示，電針很可能通過調控海馬、前額葉腦區活動改善血管性認知障礙空間學習記憶與工作記憶功能。

3.3 電針可以調控VCI大鼠海馬基因表達

既往研究表明，血管性認知障礙損傷的分子生物學機制極其復雜，與突觸結構、功能相關蛋白丟失，神經炎癥、細胞凋亡等相關分子表達異常密切相關［8，26］。研究表明，針刺可改善腦缺血損傷引起的認知缺陷，抑制海馬氧化應激、神經元凋亡損傷，通過上調Trx-1 表達，抑制ASK1-JNK/p38 通路，降低IL-6 表達，促進鈣離子釋放相關蛋白、突觸相關蛋白NMDA 受體、AMPA 受體等［7，27-28］。本研究通過全基因組芯片分析發現，電針增強血管性認知障礙大鼠海馬Klhl14、Bmp3、Npsr1、Cacna1e 等鈣通道蛋白、能量代謝、免疫調節相關分子的166 個基因表達，并抑制Insl6、Ube2k、Cdkn1c、Camp、Upk1b 等炎癥、細胞周期抑制、泛素化相關分子的233個基因表達。這說明，電針干預后VCI 大鼠多個通路的相關基因表達發生改變，提示其電針存在調控后續相關蛋白表達的可能性。但針刺治療血管性認知障礙的具體機制較為復雜，很可能是通過多靶點、多途徑發揮作用，下一步還需要開展更深入、全面的研究探討相關通路對于腦區功能活動的具體調控作用。

4 小 結

本研究證實電針百會、神庭穴可以改善血管性認知障礙大鼠認知功能，其機制可能與增強海馬、前額葉等腦區功能以及調控鈣離子、能量代謝相關分子的表達參與調節神經活動等有關，但其具體機制還有待進一步研究。