四逆湯對慢性腎功能衰竭大鼠尿酸水平及p38 MAPK/ERK1/2信號通路的影響

田芳，王鵬，孫萍，魏玉翠，李浩，仇方忻

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是多種慢性腎臟疾病的常見結局，已成為我國重要的公共衛生問題[1]。CRF的特征是腎小球濾過率降低和腎功能障礙，導致代謝紊亂和相關臨床癥狀[2]。然而，目前還沒有任何有效的治療方法來延緩或治療慢性腎功能衰竭。因此，研發成功的治療策略具有重要的臨床意義[3]。中醫藥在治療慢性腎功能衰竭方面越來越受臨床的重視[4-5]。四逆湯源自張仲景的《傷寒論》[6]。葉文沖等[7]研究發現，四逆湯可改善膜性腎病大鼠的腎小球和毛細血管結構，發揮明顯治療作用。p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)/細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)通路直接參與腎臟的形成，調節腎源性間充質的維持和分化[8]。目前，關于四逆湯治療CRF的文獻罕見報道，因此現構建CRF大鼠模型，探究四逆湯對CRF大鼠的干預作用，并分析其對p38 MAPK/ERK1/2通路的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：雄性SPF級SD大鼠，10周齡，體質量200～220 g，購自山東省實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(魯)2019-0021，動物使用許可證號：SYXK(魯)2019-0029，大鼠自由飲水進食，本實驗經山東第一醫科大學附屬青島醫院倫理委員會批準(批號：倫審字2020103號)，并遵守3R保護原則進行實驗。(2)藥物試劑：四逆湯(西安利君制藥有限責任公司)；氯沙坦鉀片(杭州默沙東制藥有限公司)；尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、尿酸(UA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；白介素-6(IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒、蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒、TUNEL檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；p38 MAPK一抗、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)一抗、ERK1/2一抗、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)一抗、β-肌動蛋白(β-actin)一抗及兔抗鼠二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。(3)儀器設備：RM2035型輪轉切片機(德國Leica公司)，SMZ745型光學顯微鏡(日本尼康公司)，Elx800型酶標儀、1658033型蛋白垂直電泳轉印系統(美國Bio-Rad公司)，GelSMART型凝膠成像儀(北京大龍興創實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗方法 2020年10月—2021年1月于山東第一醫科大學附屬青島醫院動物實驗室進行實驗，按照文獻[9]方法，對大鼠飼喂含0.75%腺嘌呤的飼料，連續飼養4周后，檢測到血清BUN和SCr水平明顯升高，表明CRF大鼠模型建立成功，成功造模60只大鼠。將CRF大鼠按隨機數字表法分成模型組、氯沙坦組(給予氯沙坦鉀片9 mg/kg，與蒸餾水配成濃度0.9 mg/ml的混懸液灌胃)[10]及四逆湯低、中、高劑量組(2.79、5.58、11.16 g/kg灌胃)[11]，每組12只；另取健康大鼠12只設為對照組，所喂養飼料除未添加腺嘌呤外，所有成分均相同。對照組和模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水；6組大鼠灌胃液體體積均為10 ml/kg，每日1次，連續4周。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 樣本采集及腎臟指數測定：大鼠末次給藥24 h后予以麻醉，主動脈取血，離心分離血清，-80℃下保存待測；采血后稱大鼠體質量，解剖腎臟并稱質量，計算腎臟指數=腎臟質量/大鼠體質量。左腎固定于4%甲醛溶液中，進行組織病理學檢測；右腎液氮速凍，-80℃下保存，用于檢測蛋白表達情況。

1.3.2 血清BUN、SCr、UA檢測：取上述血清，根據試劑盒說明書檢測大鼠血清BUN、SCr、UA水平。

1.3.3 血清炎性因子檢測：取上述血清，根據ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.3.4 腎組織病理學觀察：取出固定在甲醛中左腎組織，脫水透明，石蠟包埋，切片厚度3 μm，HE染色，于光學顯微鏡下觀察病理學變化。

1.3.5 腎組織細胞凋亡檢測：取石蠟切片，脫蠟，蛋白酶消化20 min后清洗，加入TUNEL反應混合液，于37℃下封閉30 min，加底物顯色，蘇木素復染、脫水、封片。每個實驗組分別隨機選取5張切片，每張切片選擇5個具有代表性的高倍視野(×400)，計算TUNEL染色的陽性細胞數，凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.3.6 腎臟組織蛋白表達測定：取出-80℃中保存的腎組織，液氮研磨，加入裂解液勻漿化，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白含量，電泳分離蛋白，轉膜封閉加一抗(p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin，稀釋倍數1∶1 000)，4℃條件下孵育過夜，洗膜孵二抗，室溫孵育2 h，洗膜顯色曝光，使用凝膠成像系統觀察，以β-actin為內參蛋白分析蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠腎臟指數比較 與對照組比較，模型組大鼠腎臟指數顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組大鼠腎臟指數顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組大鼠腎臟指數依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低劑量組大鼠腎臟指數顯著升高(P<0.05)，四逆湯中劑量組大鼠腎臟指數差異無統計學意義(P>0.05)，四逆湯高劑量組大鼠腎臟指數顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腎臟指數比較

2.2 各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清BUN、SCr、UA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組上述指標顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組上述指標依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低劑量組上述指標顯著升高(P<0.05)，四逆湯中劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，四逆湯高劑量組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平比較

2.3 各組大鼠血清炎性因子比較 與對照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組大鼠上述指標顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組上述指標水平依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低、中劑量組上述指標顯著升高(P<0.05)，四逆湯高劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清炎性因子水平比較

2.4 各組大鼠腎組織病理變化比較 對照組大鼠腎組織無明顯病變；與對照組比較，模型組腎小球結構紊亂，腎小球基底膜增厚，腎小球硬化纖維化，腎小管明顯擴張纖維化，間質水腫，大量炎性細胞浸潤；氯沙坦組和四逆湯各劑量組腎損害和炎性反應明顯減輕。與氯沙坦組比較，四逆湯低、中劑量組差異較為明顯，而四逆湯高劑量組無明顯差別，見圖1。

2.5 各組大鼠腎組織細胞凋亡比較 與對照組比較，模型組大鼠腎組織細胞凋亡指數顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組細胞凋亡指數均顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組細胞凋亡指數依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低劑量組細胞凋亡指數顯著升高(P<0.05)，四逆湯中劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，四逆湯高劑量組顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠腎組織細胞凋亡指數比較

2.6 各組大鼠腎組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白比較 與對照組比較，模型組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組上述指標均顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組上述指標依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低劑量組上述指標顯著升高(P<0.05)，四逆湯中劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，四逆湯高劑量組顯著降低(P<0.05)，見圖2、表5。

表5 各組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白比較

注：黃色箭頭表示腎小球

注：A.對照組；B.模型組；C.氯沙坦組；D.四逆湯低劑量組；E.四逆湯中劑量組；F.四逆湯高劑量組

3 討 論

CRF病理進程伴隨不可逆的腎單位逐漸丟失最終導致腎小球硬化、腎小管萎縮和腎臟單位數目進一步減少[12]，可產生一系列復雜的不良反應，最終導致進行性腎損傷和功能嚴重下降。高水平BUN和SCr是慢性腎功能衰竭腎功能異常的標志[13]。Li等[14]報道腺嘌呤誘導的CRF大鼠模型，可產生類似人類慢性腎病的代謝異常，包括氮質血癥、尿毒癥毒素堆積、氨基酸和電解質的代謝失衡及激素失衡。UA為嘌呤代謝的產物，可通過電壓敏感的尿酸鹽通道和尿酸鹽—陰離子交換機制在近端小管中重新吸收和排泄[15]。在腎臟疾病患者中，UA排泄減少，易造成體內UA增多。本研究采用腺嘌呤喂養大鼠，鏡下可見大鼠腎小球結構紊亂、基底膜增厚、硬化纖維化，腎小管明顯擴張纖維化，間質水腫，大量炎性細胞浸潤，大鼠腎臟指數、腎組織細胞凋亡指數，且伴隨血清中BUN、SCr、UA水平顯著升高，表明CRF大鼠模型構建成功。CRF不僅是一系列復雜的生化反應，而且是一種全身性慢性炎性反應。已有研究表明，在腎炎動物模型和患者中，促炎細胞因子IL-1β和TNF-α有助于腎炎的進展[16]。本研究亦觀察到，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高，表明CRF大鼠體內炎性反應明顯，與上述研究結果一致，提示促炎細胞因子在腎臟炎性疾病和腎小球硬化的發展中起重要作用。

四逆湯是《傷寒論》的經典方，主要治療血虛寒厥證，制附子為君，可回陽救逆、逐風寒濕邪；干姜為臣，可溫中散寒、助附回陽；炙甘草為佐，補脾益氣、調和諸藥，三藥組分配伍，具有補腎益氣之功效[7]。研究發現，組分配伍四逆湯對被動型Heymann腎炎大鼠有明顯的改善作用，可顯著降低大鼠血清中BUN、SCr、UA水平，減輕腎組織病理變化[17]。本研究觀察到，CRF大鼠在四逆湯干預作用下，腎組織病理變化明顯減輕，腎臟指數、腎組織細胞凋亡指數、血清中BUN、SCr、UA、炎性因子水平均顯著降低，表明四逆湯可改善CRF大鼠的病理狀況，減輕炎性反應。

p38 MAPK/ERK1/2途徑可被各種刺激激活，并有助于調節細胞增殖、分化、存活、凋亡等作用[18]。Tao等[19]研究發現，抑制ERK1/2表達可減輕高尿酸血癥腎病大鼠腎小管細胞上皮間質轉化和凋亡。甜菜堿可通過p38 MAPK/ERK1/2信號通路影響腎小球系膜細胞的增殖與凋亡[20]。本研究中，模型組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白水平顯著升高，說明CRF大鼠體內p38 MAPK、ERK1/2蛋白活化增強，刺激細胞凋亡。有研究發現，桂枝附子湯可抑制膠原誘導性關節炎大鼠p38 MAPK信號通路的活化，緩解炎性反應[21]。在支氣管哮喘小鼠模型中，甘草酸可抑制p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化，減輕炎性反應[22]。本研究結果顯示，四逆湯各劑量組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白水平均顯著降低，表明四逆湯可抑制p38 MAPK、ERK1/2蛋白活化，減輕腎組織炎性反應，進而改善CRF大鼠的腎組織損傷。

綜上所述，四逆湯可抑制CRF大鼠腎組織中p38 MAPK/ERK1/2信號通路的活化，降低UA水平，改善腎組織損傷，提高腎功能。然而，CRF的發病機制比較復雜，四逆湯的藥效作用仍有待于進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

田芳：設計研究方案，課題設計，實施研究過程，論文撰寫；仇方忻、王鵬：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；魏玉翠：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；孫萍、李浩：進行統計學分析