慢性乙型肝炎抗病毒新藥的臨床研究

張 洪，朱曉雪，買佳佳，陳 紅，周 景，胡 月，徐 佳，丁艷華

吉林大學第一醫院 Ⅰ期臨床試驗病房，長春 130021

HBV感染為世界性的流行，不同地區感染的流行率呈現不同程度的差異。據WHO報道，全球約有2.57億慢性乙型肝炎(CHB)患者，占全部人口的3.5%，其中西太平洋地區和非洲的HBV感染率分別高達6.2%和6.1%，而歐美的流行率相對較低[1]。治療目標為長期最大限度地抑制HBV復制，減輕肝臟炎癥、肝纖維組織增生，延緩和減少肝衰竭、肝硬化失代償等的發生，改善CHB患者生命質量，延長CHB患者生存時間。

在臨床上，CHB的治愈分為兩個層面，(1)臨床治愈：停止治療后仍保持HBsAg陰性(伴或不伴抗-HBs出現)、HBV DNA檢測不到、肝生化學指標正常、肝組織病變改善。(2)完全治愈：指的是完全根除HBV，包括肝內cccDNA和整合的HBV DNA。目前乙型肝炎的治療藥物僅局限于核苷(酸)類似物(NAs)和干擾素兩大類。NAs需要長期規范治療，存在耐藥問題，HBsAg的清除率一般也小于5%，且無法根除cccDNA。干擾素常規48周治療可以抑制HBV DNA的復制，抑制cccDNA的形成，但HBsAg的陰轉率仍很低，且存在較多的不良反應[2]。因此急需開發針對HBV不同靶點的治療新藥(圖1)。研發過程中的臨床研究顯得尤為關鍵，因此本文對抗HBV臨床研究關鍵點和代表性靶點的臨床研究進行綜述。

1 抗HBV新藥臨床研究關注點

1.1 受試人群 Ⅰa期臨床研究對象為健康受試者，主要探索新藥的耐受性和藥物代謝動力學(PK)特點。Ⅰb及Ⅱ～Ⅲ期臨床研究需要納入CHB患者。慢性HBV感染的自然史可劃分為：免疫耐受期、免疫清除期、免疫控制期和再活動期[3]。早期臨床研究應集中于無肝硬化的成年患者，例如在初治活動性疾病患者，或者NAs、干擾素停藥0.5～1年，且伴隨疾病活動的患者，或是接受NAs治療后，達到病毒學抑制的患者。重要基線特征包括HBV DNA、HBsAg、ALT水平、HBeAg陰/陽性和曾經抗病毒治療時間等。Ⅱ～Ⅲ期臨床研究人群應與藥物的作用機制匹配。例如HBsAg抑制劑可集中在NAs治療后獲得病毒抑制的患者，重點關注對抗原的抑制作用。聯合治療是HBV獲得功能性治愈的未來治療趨勢，需要分析不同靶點之間的相加或協同作用。選擇合適的人群進行治療也至關重要。建議根據受試者的基線資料進行分層，例如性別、病毒基因型和HBV傳播方式等，但需要確保每一亞組患者的數量足夠。甚至考慮肝硬化、失代償人群的治療效果和安全性[4]。

1.2 臨床試驗設計 Ⅰ期臨床試驗需要在健康受試者和HBV感染者中進行。觀察藥物的PK、耐受性、初步藥效；試驗包括單次給藥和多次給藥研究。試驗最好采用隨機、雙盲、安慰劑對照設計以提高結果的準確性，排除受試者和研究者主觀性的干擾。由于HBV需要長期治療，在耐受性試驗中給藥的時間需要足夠長，并達到穩態血藥濃度(通常連續給藥7天，除非受藥物的毒性所禁忌)。由于CHB自然病程為多階段性，Ⅱ～Ⅲ期臨床研究建議用隨機、雙盲、對照的臨床試驗來分析療效和安全性。例如，慢性抑制性治療方案和有限療程的治療方案。慢性抑制性治療方案在HBeAg陽性和陰性患者中，開展隨機、對照試驗，使用上市的藥物作為對照，以治療48周后 HBV DNA陰轉率為療效指標。有限療程的治療方案選擇HBV已被NAs抑制的人群 (NAs治療達到病毒學抑制的人群)。如果以停藥后HBV DNA保持持續抑制，且同時HBsAg轉陰作為主要療效指標，可以考慮用NAs作為背景治療，并與安慰劑比較，觀察新增的研究藥物是否提高藥效。或者分析停藥后HBV DNA是否持續抑制，以及HBsAg的下降水平。

1.3 安全、耐受性 一般而言，用于治療CHB藥物的上市申請的臨床研究應包含1000～1500例患者。根據藥物安全性和研究期間中發現的問題，可能需要更多患者和更長時間治療結果的支持。臨床研究需要制訂肝炎發作或HBV再激活的具體分析、處理標準。研究方案包括出現重大不良事件時的處理措施，確保數據合理性。在臨床研究期間，應對所有嚴重不良事件進行系統評估，鼓勵獨立評價委員會對安全耐受性進行評估。當藥物適應證人群計劃擴大到肝硬化人群時，需要考慮研究藥物的安全性和失代償肝硬化人群的總體獲益風險[5]。抗HBV藥物主要安全性問題是ALT水平反復升高，包括3種類型：第1種是由宿主免疫應答引起，伴HBV DNA、血清學標志物(例如抗原)水平的下降；第2種是由病毒活性增強所致，可能與病毒耐藥有關；第3種是由藥物的不良反應等引起，如藥物性肝損傷，可以伴有膽紅素升高，甚至凝血功能異常。為了區分不同類型的ALT升高，需要考慮治療時間、HBV DNA水平、堿性磷酸酶和膽紅素水平的變化，甚至進行肝組織學檢查。

抗HBV相關的基因編輯技術目前發展非常迅速，但是隨之而來的藥物脫靶風險也可能發生。同時藥物的載體也是潛在的風險，其分為病毒類和非病毒載體。目前多數采用的是非病毒載體，例如N-乙酰半乳糖胺作為靶向肝細胞的載體。臨床方案設計時需要制訂相應的脫靶風險控制計劃。

1.4 藥物代謝動力學(PK) 早期臨床研究中，在健康志愿者和CHB患者中進行新藥的PK研究，充分說明其PK特性及活性代謝物特征，例如性別和年齡、代謝酶、轉運體、飲食、合并用藥(藥物相互作用)、肝腎損傷等對PK影響。如果計劃用于肝病失代償人群，還應在該部分人群進行相關的PK研究。PK參數包括峰濃度、達峰時間、半衰期、從給藥開始外推到至無窮大的血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)、穩態特點、藥物經過尿糞排泄率、清除、蓄積等參數。在藥物的早期臨床開發階段，可以探索性分析暴露/效應作用特點，為后續臨床試驗和臨床應用提供指導。Ⅱb～Ⅲ期大樣本量的臨床研究中，通過稀疏采樣的PK研究，同時納入藥效終點(PD)指標進行群體PK研究。尤其是為特殊人群制訂相應的給藥方案。例如估算腎小球濾過率(eGFR)≥15 ml/min且不合并HIV感染的CHB患者中，富馬酸丙酚替諾福韋無需調整劑量，而其他NAs確需在eGFR<50 ml/min時調整用藥劑量。

1.5 藥效終點(PD) HBV功能性治愈的替代終點包括生化學、病毒學和組織學指標，其中HBsAg陰轉伴或不伴血清學轉換較難達到且對治療結局影響重大，因此HBsAg陰轉通常被當做替代終點。

在藥物的臨床研發初期，通常用HBV DNA水平的變化當做藥效指標，免疫相關的抗病毒治療可以納入免疫應答相關的指標，進行短療程、小規模的探索，并進行PK/PD分析，為后續研究提供指導。Ⅱ期臨床試驗通常為收集短期抗HBV藥效和初步安全性觀察，為Ⅲ期臨床研究的設計提供依據，例如給藥方案、試驗對象?？梢赃x擇HBV DNA的動態變化或病毒學應答作為主要終點，評價時間通常為3～6個月。甚至采用HBsAg水平作為終點進行分析，評價時間通常為6個月。對于免疫相關的抗病毒治療，需要注意免疫風暴的監測和處理[6-7]。

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Ⅲ期臨床試驗中，主要終點的設定取決于新藥的治療目標。目前已經有大量的臨床研究數據支持HBV DNA定量與肝組織學改善的關系，即研究藥物抑制HBV DNA定量后，就可以改善肝組織學。因此，在Ⅲ期臨床確證性臨床試驗中，可以選擇病毒學應答作為主要終點，療程為48周或者以上，并開展持續病毒應答的觀察。HBsAg陰轉對于臨床治療是一個非常重要的目標，可以作為研究的主要終點，但需結合持續HBV DNA抑制(HBV DNA低于定量下限)考慮。同時建議進行次要終點的觀察，例如組織學、血清學指標等。分析各指標的應答率和經時變化，例如病毒反彈包括耐藥、病毒應答與治療時間的關系。

早期臨床研究中可以評估探索性終點，促進后期臨床研究中合適終點的選擇。例如：HBV RNA、HBV核心相關抗原(HBcrAg)、HBsAg/抗-HBs免疫復合物和cccDNA定量等水平的變化。這些指標取決于藥物的作用機制。肝活組織檢查可用于某些概念驗證研究，作為確認新機制或已有的抗病毒藥物研究的替代標志物。

HBV的變異在臨床研究期間需要關注，其可能降低抗病毒藥物藥效[8]。臨床研究期間制訂HBV耐藥變異分析計劃，獲得病毒變異特點，例如HBV DNA較最低值升高2 log IU/ml時，排除依從性問題后，需及時采取措施，并進行耐藥分析。

1.6 基于定量藥理學的臨床研究 臨床研究設計、運行和結束時，引入定量藥理學研究方法，分析藥物暴露量濃度-時間AUC與不良反應及藥效學指標的關系，為后期臨床研究打下基礎。具體包括：(1)建立研究藥物的PK模型、生理藥代模型表征該化合物在健康受試者或CHB患者體內藥物代謝情況。(2)采用上述模型制訂早期患者療效試驗的給藥方式和劑量，確保暴露量能覆蓋體外抗HBV的EC50或者EC90值的數倍，或者覆蓋動物藥效學模型中暴露量的數倍，同時考慮血漿蛋白結合校正效應。(3)在臨床試驗前、方案設計時、運行期間和結束時分析藥物PK/PD及不良反應的關系，為后期研究打下基礎。分析體內藥物AUC與動物無明顯損害作用劑量和最大耐受劑量的藥物在動物體內AUC的關系；分析AUC與不良反應時，應考慮研究藥物作用機制相關的中靶和脫靶作用，以及發生率較高的不良反應。

1.7 藥物-藥物相互作用 CHB未來抗病毒治療將是不同HBV靶點新藥的聯合治療，以達到功能性治愈，因此還應盡早開展藥物相互作用研究。早期臨床試驗階段應針對藥物吸收、分布、代謝環節，如代謝酶或轉運體等，開展藥物-藥物相互作用研究，通常在健康受試者中進行。后期臨床研究也可以開展群體藥代動力學研究，有助于描述藥物-藥物相互作用，得到不同靶點抗HBV藥物合理的給藥方案。

1.8 聯合治療 參考HIV和HCV多靶點的治療成功案例，抗HBV新藥聯合治療方案目前已經被廣泛接受，目前正開展不同研發階段的臨床研究。通常為HBV復制抑制劑(NAs、核衣殼抑制劑、病毒進入抑制劑)、降低HBV抗原相關新藥(siRNA、反義RNA、核酸聚合物等)和抑制HBV相關的免疫激動劑(干擾素，治療性疫苗，TLR7、8激動劑等)之間的組合。例如羅氏制藥公司開展的NA+RG-6346(siRNA)+RO7049389(核衣殼抑制劑)組合和NA+RG-6346(siRNA)+RO7020531(TLR-7)組合。總之，Ⅰ期(早期)臨床研究應關注人群的選擇、研究設計、給藥方案、劑量組的遞增、不良事件/療效的監測和分析。而Ⅱ～Ⅲ期臨床研究則更關注療效和不良反應的評估。

2 抗HBV代表性靶點治療新藥的臨床研究

2.2 核衣殼抑制劑 核衣殼蛋白組裝抑制劑通過阻斷核衣殼裝配過程，從而影響病毒復制和cccDNA補充，故其可作為抗HBV藥物新靶點，且可以改善目前臨床上NAs存在的耐藥問題。核衣殼蛋白組裝抑制劑分為兩類，即誘導形成核衣殼碎片(Ⅰ類核衣殼蛋白抑制劑)或者形態完整的病毒核衣殼空殼(不含病毒基因組，Ⅱ類核衣殼蛋白抑制劑)。

莫非賽定的Ⅱ b期臨床研究結果顯示，治療24周后，在初治隊列莫非賽定聯合恩替卡韋治療組和恩替卡韋單藥組中HBsAg下降的均值分別為0.69和0.40 log10IU/ml。在經治隊列中，聯合治療組和恩替卡韋單藥組的HBsAg下降均值分別為0.10和0.05 log10IU/ml。聯合治療組顯示出較好的抗病毒治療效果，且優于恩替卡韋單藥組[12]。

AB-506是一款由 Arbutus Biopharma公司開發用Ⅱ類核心蛋白抑制劑。在AB-506首次人體臨床試驗中，血清HBV DNA幾乎無應答，其與預先存在的I105T位點變異有關。體外細胞培養試驗證實，T33N、T33S、I105T和T109S作為單點突變均可導致AB-506的EC50 發生2.5～356倍變化，從而導致臨床試驗失敗。提示在后續開發新型衣殼抑制劑時，應盡早進行耐藥性研究[13]。

2.3 靶向病毒mRNA的核酸干擾藥物 反義寡核苷酸和RNA干擾(RNAi)都可以靶向HBV mRNA, 從而使靶蛋白的表達降低而發揮治療作用。反義寡核苷酸主要依賴RNase H通路[14]。而RNAi是指由雙鏈小RNA，包括小干擾RNA(siRNA)和微RNA (microRNA)誘發的同源mRNA高效特異性降解的現象[15]。由于siRNA沉默病毒基因的特異性、高效性以及近年來藥物投遞材料的改進，使其成為研究的新熱點。例如Arrowhead和Janssen公司探索了RNAi藥物與核衣殼抑制劑的聯合，在JNJ3989 (RNAi藥物)+JNJ6379 (核衣殼抑制劑)+NAs的聯合方案[16]治療中，12例受試者達到了HBsAg降低超過1個log的目標。核酸干擾類藥物進入機體后可能會刺激機體引起免疫應答、或者與內源miRNA存在競爭關系和脫靶現象，后續研究需要關注[17]。

2.4 HBsAg抑制劑 HBsAg抑制劑是一類核酸聚合物，具有廣譜抗病毒活性，能抑制HBsAg的表達或者分泌[18-20]。Replicor公司開發的新藥REP 2139和REP 2165是核酸聚合物，Ⅱ期臨床結果顯示其能產生功能性治愈(持續的HBsAg陰轉)和從血液中持續清除HDV感染。REP 2139目前已經進入Ⅲ期臨床研究。替諾福韋、聚乙二醇干擾素與REP 2139或REP 2165聯用48周后，可使90%的受試者出現有意義的HBsAg下降(比基線水平下降大于10倍)，停藥48周后，39%患者達到功能性治愈且伴隨HBsAg血清學轉換[21]。

2.5 免疫調節劑

適應性免疫應答，尤其是T淋巴細胞介導的細胞免疫應答對于控制HBV復制與CHB的進展至關重要。打破HBV免疫耐受，促進患者抗HBV免疫應答恢復成為CHB治療的新突破點。

2.5.1 治療性疫苗 在慢性HBV感染過程中，T淋巴細胞耗竭或者功能受到抑制導致病毒無法被清除[22]。治療性疫苗通過特異性主動免疫，刺激CHB患者免疫系統，打破免疫耐受，清除病毒。治療性疫苗包括含有或不含有佐劑的常規HBsAg疫苗、T淋巴細胞疫苗、HBsAg免疫復合物疫苗、DNA疫苗和表達HBV蛋白的病毒載體疫苗，例如T101、GS-4774等。高病毒載量會導致CHB患者免疫功能抑制[23]，因此降低病毒載量或體內抗原負荷后，接種治療性疫苗，可能有利于激活機體免疫去抗病毒。然而，在ANRS HB02研究組開展的一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗顯示，采用表達HBsAg的DNA疫苗聯用NAs治療48周后(DNA疫苗在0、8、16、40 和44周給藥)，并沒有降低NAs停藥后HBV復發以及恢復抗病毒相關的免疫應答[23]。因此，如何提高HBV特異性免疫應答，并延長其應答時間，是治療性疫苗研發過程需要解決的問題。

2.5.2 TLR激動劑 正大天晴和強生公司的TLR7激動劑JNJ-4964 (TQ-A3334) 正在CHB患者中開展臨床Ⅱa期研究，結果尚未公布。但在健康受試者中進行的單劑量遞增Ⅰ期臨床研究[24]中，表現出了一定藥效，包括ISG(MX1、ISG15、OAS1), IFNγ和IP-10等，提示其具有抗HBV的潛能。GS-9688(Selgantolimod)是選擇性口服小分子TLR8激動劑，目前在CHB患者中開展臨床Ⅱ期研究。在第24周，沒有患者達到HBsAg水平下降≥1 log10IU/ml的主要終點，藥效不明顯[25-26]。

3 總結

目前靶向HBV生命周期各個靶點的新型抗病毒藥物正在進行或即將進入臨床試驗，包括進入抑制劑、病毒轉錄抑制劑、核衣殼組裝調節劑、HBsAg抑制劑和免疫調節劑等。然而采用何種策略的藥物組合來抗HBV還需要臨床試驗去驗證。借鑒HCV DAA藥物成功的經驗，多途徑、多靶點、多藥物聯合阻斷HBV的治療方案可能成為實現HBV感染根治的重要途徑。研發過程中的臨床研究為研發的關鍵環節，根據藥物作用機制選擇合適人群、合理的給藥方案、盡早發現藥物的不良反應、探索待研究藥物較其他抗HBV藥物的優勢，最終促進CHB得到治愈。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張洪、丁艷華負責提出研究選題、撰寫論文和修訂論文；朱曉雪、買佳佳、陳紅、周景、胡月、徐佳負責文獻資料的檢索和整理。