滯綠突變對(duì)大豆葉片蔗糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

王 鵬 侯思宇,2 溫宏偉 李貴全*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801)

高等植物的滯綠是指葉綠素降解緩慢或降解程度較低，葉片能夠在生育末期長(zhǎng)時(shí)間保持綠色，甚至完全不發(fā)生黃化的現(xiàn)象[1]。目前，已利用人工誘變手段在小麥、玉米、水稻、擬南芥和番茄等作物中獲得了大量的滯綠突變體材料，各種滯綠突變體的成因及滯綠機(jī)理都存在一定的差異[2]。大豆中已鑒定出4個(gè)基因位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致滯綠，其中cytG為細(xì)胞質(zhì)遺傳位點(diǎn)，D1和D2雙基因突變導(dǎo)致種子滯綠，G與D1連鎖，其突變會(huì)導(dǎo)致種皮發(fā)生滯綠[3]。

糖是植物體內(nèi)重要的碳水化合物，由高等植物通過(guò)光合作用產(chǎn)生。蔗糖和己糖作為主要的可溶性糖類，均可以充當(dāng)信號(hào)調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與細(xì)胞糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程，是植物生長(zhǎng)發(fā)育和一些基因表達(dá)的重要調(diào)控因子[4]。蔗糖和己糖的代謝過(guò)程需要多種酶共同參與。其中，蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖合成的限速酶[5]，催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和6-磷酸果糖生成6-磷酸蔗糖和UDP，6-磷酸蔗糖再由蔗糖磷酸化酶(SPP)去磷酸化生成蔗糖。蔗糖需要通過(guò)水解為己糖才能被植物所吸收利用，而不能直接作為能源物質(zhì)為植物提供能量[6]。轉(zhuǎn)化酶(Inv)是蔗糖裂解的關(guān)鍵酶，催化蔗糖水解產(chǎn)生己糖(葡萄糖和果糖)。蔗糖合酶(SS)催化蔗糖分解與合成的可逆反應(yīng)[7]，大豆葉片中SS分解方向的活性更大，主要參與蔗糖分解的調(diào)節(jié)作用[8]。己糖在己糖激酶的催化下發(fā)生磷酸化反應(yīng)，進(jìn)入糖酵解途徑，進(jìn)而為植物的生理活動(dòng)提供能量和中間代謝產(chǎn)物[9]。廣義的己糖激酶依據(jù)其底物特異性和功能的不同分為己糖激酶(Hxk)、葡萄糖激酶(Gxk)和果糖激酶(Frk)。有證據(jù)表明，己糖激酶能夠直接或間接參與植物的糖感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[10]，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[11]，以及調(diào)控植物激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等[12]。植株生長(zhǎng)發(fā)育后期，源葉中的碳水化合物以蔗糖的形式轉(zhuǎn)移輸送至籽粒中，以保證籽粒生長(zhǎng)的需要。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Sucrose transporters, SUTs)是蔗糖的特異性感受器，SUTs可以特異性感受胞內(nèi)蔗糖水平或蔗糖信號(hào)，并通過(guò)調(diào)節(jié)自身或其他一些相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，對(duì)其作出應(yīng)答反應(yīng)[13]。

關(guān)于滯綠突變體的研究，多數(shù)集中于滯綠形成的分子機(jī)理以及滯綠基因的結(jié)構(gòu)變異和功能解析[14]。在小麥和水稻等少數(shù)作物中，還探討了滯綠突變對(duì)植物碳氮代謝和抗氧化生理帶來(lái)的影響[15]。然而，涉及大豆滯綠突變體生理生化特性及相關(guān)分子機(jī)制的研究還鮮有報(bào)道。Thomas和Howarth[2]將滯綠突變體劃分為5種類型，并進(jìn)一步歸納為功能型和非功能型兩大類別。研究表明，一些功能型滯綠突變體能夠在阻止葉綠素降解的同時(shí)，相應(yīng)地維持葉片光合能力的穩(wěn)定，有效延長(zhǎng)光合效率高值持續(xù)期[16]，并且相較于其野生型獲得更好的產(chǎn)量表現(xiàn)[17]。大豆光合作用的主要產(chǎn)物是蔗糖[18]，并且蔗糖也是碳水化合物源庫(kù)運(yùn)輸?shù)闹饕问健Ｒ虼送茰y(cè)，滯綠突變可能會(huì)對(duì)大豆光合產(chǎn)物蔗糖的積累，蔗糖代謝轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶活性以及相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響。

本研究以晉大滯綠1號(hào)及其親本晉大74號(hào)為試驗(yàn)材料，分析了大豆開(kāi)花后至成熟期間葉片可溶性糖含量的變化趨勢(shì)，對(duì)比了不同基因型大豆葉片衰老過(guò)程中蔗糖代謝相關(guān)酶基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式，旨在闡明滯綠突變對(duì)大豆葉片蔗糖代謝相關(guān)功能基因表達(dá)產(chǎn)生的影響，以期為進(jìn)一步研究滯綠突變對(duì)大豆碳氮代謝調(diào)控的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為晉大滯綠1號(hào)(Z1)大豆新品種，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種研究室自主選育，已通過(guò)陜西省品種審定委員會(huì)審定。該品種是以大豆自然滯綠突變體為父本，超高產(chǎn)品種晉大74號(hào)(JD74)為母本進(jìn)行雜交，通過(guò)系譜法選育而來(lái)，具有典型的滯綠表型。以非滯綠親本晉大74號(hào)作為對(duì)照。供試的2個(gè)大豆品種均為亞有限結(jié)莢習(xí)性，花期接近，晉大滯綠1號(hào)生育期為132 d，晉大74號(hào)生育期為129 d。

1.2 田間設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)于2017年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)品種種植3個(gè)重復(fù)小區(qū)，每小區(qū)6行，行長(zhǎng)6 m，行距0.5 m。田間常規(guī)管理，及時(shí)中耕除草。開(kāi)花期每個(gè)品種選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、同一天開(kāi)花的植株掛牌標(biāo)記(晉大滯綠1號(hào)為7月17日，晉大74號(hào)為7月15日)，之后每隔7 d取樣，如遇陰雨天順延。樣本選取標(biāo)記植株全展的倒二功能葉，該葉位為新生葉片，能夠反映植株的光合效率和生理特征。每次選取3片復(fù)葉中的1～2片，迅速冷凍于液氮當(dāng)中，然后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用，用于生理指標(biāo)測(cè)定和相關(guān)基因表達(dá)分析。

1.3 可溶性糖含量測(cè)定

可溶性糖含量測(cè)定采用蔥酮硫酸法[19]。新鮮葉片烘干后，研磨至均勻粉末，稱取50 mg粉末倒入具塞試管中，加5 ml 80%乙醇，80 ℃水浴浸提30 min，期間不斷攪拌。冷卻到室溫后，3 500 r離心10 min，取上清。沉淀加入2 ml 80%乙醇，重復(fù)清洗2次，合并上清。加入10 mg活性炭，80 ℃脫色30 min，用80%乙醇定容至10 ml。測(cè)定體系為：提取液1 ml，蒸餾水2 ml，蒽酮硫酸試劑5 ml。100 ℃ 水浴中煮10 min，冷卻后測(cè)620 nm下吸光度值。

1.4 基因表達(dá)分析

大豆總RNA提取參照Trizol kit(天根生化科技(北京)有限公司)操作說(shuō)明，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品含量和純度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。提取的總RNA經(jīng)DNase I (TaKaRa)消化后去除基因組DNA污染，取2 μg用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FastQuant RT Kit，天根生化科技(北京)有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，冰上操作。采用SYBR Green I PCR kit (TaKaRa)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以HIS2作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本重復(fù)3次，采用2-ΔΔ法進(jìn)行基因表達(dá)分析。熒光定量PCR引物通過(guò)NCBI在線設(shè)計(jì)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和圖表繪制，利用IBM SPSS 20.0通過(guò) Duncan’s多重比較(α=0.05)對(duì)同一時(shí)期不同品種基因表達(dá)差異進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖含量的變化

不同大豆品種在花后不同天數(shù)可溶性糖含量的變化見(jiàn)圖1。由圖1可知，花后至成熟期間，2個(gè)供試大豆品種葉片中可溶性糖含量均呈波動(dòng)升高然后降低的變化趨勢(shì)。開(kāi)花期(花后0 d)，2個(gè)品種中可溶性糖含量無(wú)顯著差異；花后14至42 d，滯綠品種Z1可溶性糖含量高于JD74，且花后14、21和42 d達(dá)到顯著水平。花后36和42 d，JD74和Z1可溶性糖含量分別達(dá)到最大水平，之后逐漸降低。其中，JD74降低速率小于滯綠品種Z1，并于開(kāi)花55 d后顯著高于Z1。

2.2 蔗糖合成基因表達(dá)的變化

圖2(a)表明，開(kāi)花期(花后0 d)2個(gè)SPS同工酶基因在葉片中的表達(dá)量差距較大，其中滯綠品種Z1中的SPS4基因表達(dá)量顯著低于JD74，SPS3基因表達(dá)量顯著高于JD74。花后至成熟期間，SPS4和SPS3基因表達(dá)量在2個(gè)供試大豆品種中具有相似的變化趨勢(shì)(圖2(b)和(c))。花后0至7 d維持在較高水平，花后7至21 d大幅下調(diào)，此后逐漸升高。開(kāi)花55 d后，滯綠品種Z1中2個(gè)SPS同工酶基因表達(dá)量均迅速降低；JD74中SPS4基因表達(dá)量迅速下降，而SPS3基因表達(dá)量則持續(xù)上調(diào)。鼓粒初期和中期(花后29至42 d)，除花后36 d外滯綠品種Z1中SPS4、SPS3基因表達(dá)量均顯著高于JD74。此外，因SPS3基因表達(dá)水平較低，推測(cè)其對(duì)大豆葉片蔗糖代謝的影響較小。

2.3 蔗糖裂解相關(guān)基因表達(dá)的變化

通過(guò)與擬南芥基因組進(jìn)行同源比對(duì)，選擇了1個(gè)大豆中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因CInv以及2個(gè)酸性轉(zhuǎn)化酶基因CWInv1和CWInv2進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果表明，開(kāi)花期(花后0 d)CInv和CWInv2在葉片中具有較高的表達(dá)水平(圖3(a))，其中JD74表達(dá)量顯著高于滯綠品種Z1；CWInv1表達(dá)量極低，且2個(gè)品種之間的差異不顯著。花后至成熟期間，CInv和CWInv2基因表達(dá)量在滯綠品種Z1中呈現(xiàn)出明顯的“V”型變化曲線(圖3(b)和(d))，于花后36 d降至最低水平；在常規(guī)品種JD74中則表現(xiàn)為“W”型變化曲線，花后29至42 d經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的低水平表達(dá)期。2個(gè)供試品種CWInv1基因在前期表達(dá)量極低(圖3(c))，后期大幅升高。其中，滯綠品種Z1上調(diào)時(shí)期早于JD74，花后36至55 d，CWInv1基因表達(dá)量顯著高于JD74。

蔗糖合酶(SS)能夠?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖和果糖，并且根據(jù)植物的需要可逆性調(diào)節(jié)蔗糖與己糖之間的相互轉(zhuǎn)化。由圖4(a)可知，開(kāi)花期(花后0 d)SS同工基因在葉片中的表達(dá)量依次為SS2-2>SS1>SS2-1，各基因表達(dá)水平在供試品種中無(wú)顯著差異。開(kāi)花3周內(nèi)供試的2個(gè)品種SS1基因表達(dá)量均維持在較低的水平(圖4(b))。花后29至42 d，滯綠品種Z1中SS1基因表達(dá)量大幅上升，且顯著高于JD74；開(kāi)花42 d后，JD74中SS1基因表達(dá)量大幅上升，且在花后55至68 d顯著大于Z1。SS2-1基因表達(dá)量先降低后升高(圖4(c))，除花后29 d外，JD74中SS2-1基因的表達(dá)量在多數(shù)時(shí)期都顯著高于滯綠品種Z1中的表達(dá)量。SS2-2基因表達(dá)量表現(xiàn)為升-降-升的變化趨勢(shì)(圖4(d))，滯綠品種Z1于花后36 d降至最低水平，隨后迅速上調(diào)，呈明顯的“V”型曲線；常規(guī)品種JD74低水平表達(dá)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，為花后29至42 d，呈“W”型曲線。結(jié)果表明，SS2-2基因表達(dá)量在大豆葉片中的波動(dòng)幅度較大，說(shuō)明其對(duì)內(nèi)原糖水平的變化比較敏感。

表1 RT-qPCR引物序列信息Table 1 Information of sequences of primers used for RT-qPCR

JD74代表晉大74號(hào), Z1代表晉大滯綠1號(hào); 誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差; *代表在0.05水平上差異顯著; **代表在0.01水平上差異顯著。下同。JD74 represents Jinda No.74, Z1 represents Jinda Zhilv No.1; The error bars indicate standard deviation; *, indicates significant differences at 0.05 level; **, indicates significant differences at 0.01 level. The same below.圖1 不同大豆品種可溶性糖含量的變化Fig.1 The changes of soluble sugar in leaves of various soybean varieties

2.4 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SUTs表達(dá)的變化

如圖5(a)所示，7個(gè)SUT同工基因中，SUT4-1表達(dá)量前期維持在極低的水平，后期在各品種中均大幅升高。花后29至55 d，滯綠品種Z1中SUT4-1基因表達(dá)量高于JD74，且在花后36和42 d達(dá)到顯著水平；直到成熟末期(花后68 d)，JD74中SUT4-1基因表達(dá)量才顯著高于Z1。其余6個(gè)SUT同工基因在不同品種中分別具有相似且典型的表達(dá)特征，表現(xiàn)出明顯的品種特異性(圖5(b)和(c))。其中，滯綠品種Z1的表達(dá)僅在花后36 d明顯降低，此后迅速升高，大致呈“V”型變化曲線；而常規(guī)品種JD74在花后29至42 d均維持低水平表達(dá)，呈明顯的“W”型曲線。

圖2 不同大豆品種葉片SPS同工酶基因表達(dá)的變化Fig.2 The changes of SPS isozyme genes expression in leaves of various soybean varieties

圖3 不同大豆品種葉片Inv同工酶基因表達(dá)的變化Fig.3 The expression changes of Inv isozyme genes in leaves of various soybean varieties

圖4 不同大豆品種葉片SS同工酶基因表達(dá)的變化Fig.4 The expression changes of SS isozyme genes in leaves of various soybean varieties

圖5 不同大豆品種葉片SUT同工酶基因表達(dá)的變化Fig.5 The expression changes of SUT isogenes in leaves of various soybean varieties

2.5 己糖激酶同工酶基因Hxks和Frks表達(dá)的變化

如圖6(a)所示，開(kāi)花期(花后0 d)Hxk2基因表達(dá)量高于Hxk1，且JD74中Hxk2基因的表達(dá)量顯著高于Z1。花后至成熟期間，Hxk1基因在2個(gè)品種中的表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致(圖6(b))，花后持續(xù)下降并長(zhǎng)時(shí)期維持極低的表達(dá)水平，后期表達(dá)量大幅上升且在花后55 d到達(dá)表達(dá)量峰值后迅速下降，其中滯綠品種Z1中的表達(dá)量在花后42和55 d顯著大于JD74中的表達(dá)量。各品種Hxk2基因表達(dá)量前期大幅升高后，均經(jīng)歷一個(gè)迅速下降的過(guò)程(圖6(c))。Z1的表達(dá)水平于花后36 d降至最低，之后迅速上升并基本保持穩(wěn)定；JD74的表達(dá)量則在花后29到42 d一直維持較低水平。

己糖激酶中還包括一類在果糖識(shí)別中起特異性作用的果糖激酶(Frk)，植物體內(nèi)通常含有多種編碼Frk的基因。依據(jù)它們的蛋白質(zhì)活性和氨基酸序列，這些基因可以被劃分為Frk1和Frk2兩類。圖6(d)結(jié)果表明，開(kāi)花期(花后0 d)Frk1和Frk2基因表達(dá)水平差別不大，JD74中的表達(dá)水平顯著高于滯綠品種Z1。花后至成熟階段，2個(gè)品種中Frk1和Frk2的表達(dá)水平均呈現(xiàn)為升-降-升的變化趨勢(shì)(圖6(e)和(f))。結(jié)莢期(花后14至29 d)，除花后21 d外，滯綠品種Z1中的表達(dá)水平均顯著高于JD74。鼓粒前期和中期(花后29至42 d)，除花后36 d外，JD74中的表達(dá)水平均顯著低于滯綠品種Z1。

圖6 不同大豆品種葉片Hxk和Frk同工酶基因表達(dá)的變化Fig.6 The expression changes of Hxk and Frk isozyme genes in leaves of various soybean varieties

3 討 論

蔗糖是葉片光合作用的主要產(chǎn)物，也是光合同化物源庫(kù)運(yùn)輸?shù)闹饕问健Ｖ参矬w內(nèi)蔗糖代謝的過(guò)程需要多種酶共同參與，蔗糖代謝相關(guān)酶活性的變化會(huì)直接影響葉片的糖分積累[20]。其中，SPS主要負(fù)責(zé)催化蔗糖的合成，是蔗糖合成的限速酶。研究表明，SPS可以調(diào)節(jié)小麥旗葉光合產(chǎn)物向蔗糖的轉(zhuǎn)化[21]。SPS家族基因的表達(dá)水平與蔗糖的積累呈明顯的正相關(guān)[22]。抑制擬南芥SPS基因的表達(dá)，會(huì)明顯減少蔗糖的合成[23]。本研究結(jié)果表明，2個(gè)SPS同工基因在大豆葉片中具有相似的表達(dá)模式，在鼓粒前中期(花后29至42 d)，除花后36 d外，滯綠品種Z1中SPS基因的表達(dá)量顯著高于JD74，表明此階段滯綠品種具有較強(qiáng)的蔗糖合成能力。但Lunn等[24]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化集胞藻SPS基因至一些作物中，雖然使得SPS高水平表達(dá)，但沒(méi)有明顯提高轉(zhuǎn)基因作物葉片SPS活性和碳的分配。Park等[25]也發(fā)現(xiàn)，擬南芥SPS基因轉(zhuǎn)化煙草后，SPS轉(zhuǎn)錄豐度及酶活性在轉(zhuǎn)基因植株莖和葉中均有所提高，但是蔗糖含量在莖中增加而在葉片中降低。本研究結(jié)果也證實(shí)，大豆葉片衰老后期SPS基因表達(dá)量上升的階段(花后42～55 d)，糖水平反而下降，推測(cè)這種現(xiàn)象是由于鼓粒和成熟期蔗糖從葉片向莖稈和籽粒等庫(kù)器官轉(zhuǎn)運(yùn)而造成的。

轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖裂解，產(chǎn)生己糖，轉(zhuǎn)化酶基因的過(guò)表達(dá)能夠造成己糖積累或葉片細(xì)胞滲透壓升高，從而降低轉(zhuǎn)基因植物葉片的光合速率[26]。Inv的表達(dá)隨蔗糖濃度的不同而發(fā)生變化，低糖時(shí)抑制效果不明顯，糖水平越高抑制作用越明顯[27]。本研究表明，大豆開(kāi)花后葉片可溶性糖含量逐漸升高，花后29至42 d，葉片可溶性糖含量逐漸積累至最高水平，此時(shí)CInv和CWInv2基因表達(dá)量受到高糖水平的抑制降至最低水平。之后，隨著光合速率的下降，光合產(chǎn)物積累減少，糖水平的降低逐漸解除這種抑制，CInv和CWInv2表達(dá)量逐漸上調(diào)。CWInv1前期表達(dá)水平一直很低，說(shuō)明其對(duì)糖水平更加敏感，直到后期由于光合速率下降，蔗糖水平降低，才大幅上調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明，Inv同工酶基因在大豆葉片中的表達(dá)受糖水平的精確調(diào)控，Inv在葉片衰老前期的表達(dá)可能受高水平糖的抑制。

己糖激酶除具有己糖磷酸化功能外，還廣泛參與植物的糖感知和糖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。先前研究表明，Hxk1的表達(dá)隨外源糖處理濃度的升高而逐漸被抑制，Hxk2則表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制。2個(gè)Hxk同工酶基因?qū)τ谕庠刺堑奶幚響?yīng)對(duì)機(jī)制稍有不同，但高濃度均抑制Hxk的表達(dá)[27]。本研究也表明，大豆己糖激酶同工酶基因表達(dá)的變化趨勢(shì)與葉片內(nèi)源糖水平有著密切的聯(lián)系，受糖信號(hào)調(diào)控。Hxk1和Hxk2低水平表達(dá)階段正是SPS表達(dá)升高，葉片通過(guò)光合作用產(chǎn)生碳水化合物能力最高的階段(花后29～42 d)。開(kāi)花前期(0～21 d)SPS表達(dá)降低，光合速率下降，葉片內(nèi)包括蔗糖在內(nèi)的各種糖類物質(zhì)積累水平較低。同時(shí)，由于SS和Inv等蔗糖裂解酶類同工酶基因和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SUTs基因都處在比較穩(wěn)定的表達(dá)狀態(tài)，葉片內(nèi)部糖水平?jīng)]有發(fā)生較大變化，使得Hxk2在低糖環(huán)境中逐漸升高其表達(dá)水平。花后29～42 d，SPS表達(dá)水平逐漸提高，葉片光合速率也開(kāi)始上升，產(chǎn)生糖類等碳水化合物的能力提高，同時(shí)大多數(shù)SS、Inv和SUT等同工酶基因表達(dá)量降低，造成蔗糖和己糖水平迅速提高，從而抑制了Hxk2的表達(dá)。由此可見(jiàn)，大豆源葉中存在復(fù)雜的碳水化合物轉(zhuǎn)化代謝，其中各個(gè)環(huán)節(jié)都受到糖水平的精確調(diào)控，這種轉(zhuǎn)化代謝對(duì)于葉片的衰老進(jìn)程起著重要的作用。研究表明，葉片衰老過(guò)程與己糖的積累有關(guān)[28]，并且Hxk依賴性的糖信號(hào)起了重要的作用[24]。非滯綠品種JD74Hxk和Frk表達(dá)量除個(gè)別時(shí)期外，整體都低于滯綠品種Z1，并且期間會(huì)經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的低水平表達(dá)期(花后29～42 d)，因此限制了體內(nèi)己糖的磷酸化和進(jìn)一步的代謝，造成己糖出現(xiàn)一定程度的積累，因此葉片衰老速度要大于滯綠品種。

綜上所述，滯綠突變確實(shí)對(duì)大豆葉片蔗糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生了較大的影響，特別是在鼓粒初期和中期(花后29～42 d)。有研究表明，在大豆開(kāi)花期及隨后的籽粒建成期，葉片源活性的改變以及光合同化物的含量、形式和轉(zhuǎn)運(yùn)均會(huì)影響大豆籽粒數(shù)量和百粒重等重要的產(chǎn)量性狀[29]。先前的研究結(jié)果也表明，與親本晉大74相比，晉大滯綠1號(hào)在葉片衰老過(guò)程中，葉綠素降解程度降低，光合機(jī)構(gòu)更加穩(wěn)定，光合效率高值持續(xù)期延長(zhǎng)，因此獲得了更好的產(chǎn)量表現(xiàn)[30]。特別是單株粒數(shù)和單株粒重這兩個(gè)重要的產(chǎn)量性狀，也都高于親本晉大74。結(jié)合本研究結(jié)果分析，滯綠品種在產(chǎn)量表現(xiàn)及產(chǎn)量性狀上的優(yōu)勢(shì)可能源于其葉片蔗糖代謝的變化。此外，王文強(qiáng)[31]的研究結(jié)果表明，小麥滯綠突變體灌漿期旗葉全氮含量、游離氨基酸含量以及氮素代謝相關(guān)酶活性均高于其野生型。但是，關(guān)于滯綠突變對(duì)大豆籽粒品質(zhì)影響的研究還鮮有報(bào)道。因此，滯綠大豆碳氮代謝及籽粒建成的相關(guān)生理及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，滯綠突變對(duì)于大豆葉片蔗糖代謝相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生的影響集中體現(xiàn)在鼓粒初期和中期(花后29～42 d)。除花后36 d外，滯綠品種Z1參與蔗糖合成和裂解的關(guān)鍵同工酶基因表達(dá)均較為活躍。己糖激酶和果糖激酶同工酶基因Hxk2、Frk1和Frk2的表達(dá)量也高于非滯綠品種JD74。SUT1-1、SUT1-2、SUT3、SUT4-2、SUT4-3和SUT8等6個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體同工酶基因的表達(dá)模式具有明顯的品種特異性，滯綠品種Z1葉片SUTs表達(dá)水平高于非滯綠品種JD74。