北京地區梨樹主要病毒和類病毒檢測

曾 棋 黃聞霆 池 海 王勝男 姜 峰 李天忠 程玉琴

(中國農業大學 園藝學院，北京 100193)

病毒病是影響梨果產量和品質的重要因素之一。據報道，有21種病毒可侵染梨樹[1]。最近在我國又發現了1種侵染梨樹的新病毒，暫命名為梨褪綠葉斑伴隨病毒(pear chlorotic leaf spot-associated virus)[2]。研究表明蘋果莖溝病毒(apple stem grooving virus, ASGV)、蘋果莖痘病毒(apple stem pitting virus, ASPV)和蘋果褪綠葉斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)是梨樹上發生最普遍的3種重要病毒[3]。此外，蘋果銹果類病毒(apple scar skin viroid，ASSVd)在世界各地梨栽培地區也普遍發生，嚴重影響梨果產量和品質[4]。

病毒和類病毒在梨樹上通常為復合侵染[5]，帶毒無性繁殖材料和帶毒嫁接是其傳播的主要途徑。因此摸清現有梨樹上主要病毒和類病毒的發生情況對于防控梨病毒病害具有十分重要的意義。

我國梨栽培面積和產量均為世界第一，其中河北、安徽、河南、新疆、遼寧、陜西和山東等主產區的種植面積占我國梨種植總面積的一半左右，產量約為我國梨總產量的64%[6]。梨也是北京地區出產的第二大水果。據統計，2017年北京梨栽培面積為6 700 hm2，產量達9.07萬t[6]，梨產業已成為帶動北京農業經濟發展的支柱產業之一。但是目前對于該地區梨樹感染病毒和類病毒的情況尚不清楚。由于ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd在世界各地梨樹栽培地區發生普遍，因此，本研究利用RT-PCR方法對采自北京市重要梨果生產區縣的157份梨樹樣品進行ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd檢測，旨在評估北京地區梨樹的健康狀況并明確感染病毒和類病毒的主要種類，以期為管理和規范梨苗木生產和健全苗木檢疫制度提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

陽性對照為已知感染ASGV+ASPV+ACLSV+ASSVd的‘冬蜜’和‘碭山酥梨’，栽種在中國農業大學上莊試驗基地。陰性對照為本課題組保存的‘紅寶石’和杜梨脫毒組培苗。

DNA分子量標準購自中科瑞泰生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(EASY spin plant RNA extracting kit)購自北京博邁德基因工程技術有限公司；瓊脂糖購自Sigma公司；PCR預混液(2×TaqMasterMix)購自康為世紀生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品采集

2019年和2020年的10月下旬在北京市門頭溝、大興和海淀區的10個梨園中采集了157份樣品，包括‘京白梨’、‘鴨梨’、‘園黃梨’、‘豐水梨’、‘玉露香’、‘黃冠’和‘翠冠’等51個栽培品種。門頭溝區的東山和王平等4個果園的梨品種均為‘京白梨’，樹齡大多為15年左右，每個果園隨機選擇12～15 棵樹采集樣品，其中在東山果園還另采集2株百年樹齡樣品。大興和海淀區6個梨園的梨樹樹齡為1～20年，在每個果園對每個梨品種隨機選取1棵梨樹進行樣品采集。

從每棵梨樹上采集一年生枝條2份，隨后在室內分別剝取樣品的韌皮部組織并保存在-80 ℃冰箱中待用。

在所有調查的果園中，梨樹均為嫁接苗，砧木是杜梨。本研究進行調查和采樣的時間為10月底，絕大多數果園的梨樹葉子已開始變黃，有些果園的梨樹甚至開始落葉，同時由于病毒在梨樹上通常為潛隱性侵染，因此在采樣時未能觀察到梨樹上有明顯病毒病癥狀。

1.2.2檢測引物

根據NCBI上ACLSV復制酶(Putative viral replicase)基因序列信息，自行設計檢測引物。ASGV、ASPV和ASSVd的檢測引物均參考已發表文獻[7-9]。引物由生工生物工程有限公司合成。引物名稱、序列、退火溫度和擴增片段大小如表1所示。

1.2.3總RNA提取

將一年生梨枝條韌皮部組織(100 mg)加液氮研磨成粉末。將粉末轉移到2 mL的離心管中，然后按照RNA提取試劑盒的操作手冊提取總RNA。

1.2.4RT-PCR

在0.2 mL的PCR管中加入8 μL總RNA、8 μL RNase free H2O和4 μL 5×TRUE RT MasterMix(試劑盒自帶)，用移液槍吸打混勻。25 ℃ 孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。

反轉錄后隨即進行PCR擴增。25 μL的擴增體系中包括2 μL cDNA、2. 5 μL 10×buffer緩沖液、2 μL dNTP、各0. 5 μL的正向和反向引物(20 μmol/L)、0. 2 μL DNA聚合酶(5 U/μL)及17. 3 μL ddH2O。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，54～60 ℃退火30 s (退火溫度詳見表1)；72 ℃延伸24～45 s(根據產物長度確定)，35個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，同時選取部分樣品的PCR產物送去測序以驗證檢測結果。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結果與分析

2.1 RT-PCR檢測ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd

利用RT-PCR方法檢測陽性對照梨樹樣品(‘冬蜜’和‘碭山酥梨’)中的病毒和類病毒，陰性對照為‘紅寶石’和杜梨脫毒組培苗。由圖1可知，在2個陽性樣品‘冬蜜’和‘碭山酥梨’中均擴增到ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的特異性條帶，而在陰性對照‘紅寶石’和杜梨脫毒組培苗中則未出現特異性擴增條帶。為了進一步確定檢測結果，將陽性樣品的PCR產物送公司測序。將測序結果在NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行比對分析，結果顯示這些擴增產物分別為病毒和類病毒對應的基因片段。上述結果表明，本研究所采用的RT-PCR方法可特異性地檢測梨樹樣品中的ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd。

M， DNA分子量標準(100～2 000 bp)；泳道1～4，分別為ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的檢測結果。M, DNA molecular weight marker (100-2 000 bp). Lanes 1-4, PCR products for detection of ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd, respectively.圖1 RT-PCR檢測梨樹樣品ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVdFig.1 Detection of ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd in pear samples by RT-PCR

2.2 北京地區梨樹樣品病毒和類病毒的檢測結果分析

利用RT-PCR對北京地區采集的所有梨樹樣品進行ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd檢測。其中在檢測采自門頭溝區4個果園的51份‘京白梨’樣品時發現，同一果園的不同‘京白梨’植株，其感染病毒的種類也不盡相同。以采自門頭溝區東山果園的樣品為例，對9個‘京白梨’樣品進行RT-PCR檢測(圖2)，其中泳道1和3分別是采自2株百年樹齡‘京白梨’的樣品，泳道2、泳道4～9分別為采自不同株15年樹齡梨樹的樣品。圖2(a)顯示了從各樣品所提取的總RNA，其28S和18S條帶清晰，且前者寬度約為后者的兩倍；圖2(b)顯示了在各樣品中均擴增到內參基因actin的特異性條帶，這些結果再次表明RT-PCR檢測體系的可靠性。由圖2(c)～(f)可知，9個‘京白梨’樣品所感染的病毒種類并不相同。其中2株百年樹齡老樹(泳道1和3)和1株15樹齡梨樹(泳道7)均感染了ASGV、ASPV、ACLSV 和ASSVd。在其它6株15年樹齡的‘京白梨’中， 1株(泳道8)感染了ASGV，3株(泳道5、6和9)感染了ASGV+ACLSV，1株(泳道2)感染了ASGV+ASSVd，1株(泳道4)則感染ASGV+ACLSV+ASSVd。采自門頭溝區其它3個果園的‘京白梨’樣品也顯示出相似的檢測結果(表2)。

(a)總RNA電泳圖;(b)～(f)分別為擴增內參基因actin、ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的PCR產物電泳結果；M,DNA分子量標準；P,陽性樣品(‘冬蜜’)；N,陰性對照(‘紅寶石’脫毒組培苗)；泳道1～9，分別為采自門頭溝區東山果園的9個‘京白梨’樣品。(a) Total RNA; (b)-(f) PCR products for detection of actin (the internal reference gene), ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd, respectively. M, DNA molecular weight marker. P, positive control sample (‘Dongmi’). N, negative control sample (virus-free pear ‘Hongbaoshi’ plantlets). Lanes 1-9, nine ‘Jingbaili’ samples collected from Dongshan orchard in Mentougou district.圖2 RT-PCR檢測部分‘京白梨’樣品病毒和類病毒Fig.2 RT-PCR detection of viruses and viroids in several pear (‘jingbaili’) samples

表2 門頭溝不同果園‘京白梨’樣品中病毒和類病毒的發生情況分析Table 2 Occurrence of viruses and viroids in pear (‘Jingbaili’) samples collected from different orchards

對大興、海淀及門頭溝區果園中的‘翠冠’,‘黃冠’,‘玉露香’和‘京白梨’等51個品種總計157份梨樹樣品的檢測結果進行分析(表3)，北京地區梨樹上普遍感染了ASGV，檢出率高達91.1%。其中采自門頭溝區的51個‘京白梨’樣品均檢出ASGV，檢出率為100%；采自大興區的45個樣品和海淀區的61個樣品中，該病毒的檢出率分別為97.8%和78.7%。

北京地區梨樹ASPV和ASSVd的檢出率分別為59.2%和54.8%，其中采自海淀區的樣品中ASPV和ASSVd的檢出率相對較高，分別為73.8%和65.6%，而在大興和門頭溝區的梨樹樣品中ASPV和ASSVd的檢出率相對較低。梨樹樣品中ACLSV的檢出率較低，為35.7%，但該病毒的檢出率在不同采樣地點間的差異較大。其中在門頭溝區‘京白梨’樣品中，該病毒的檢出率高達92.2%，而在大興和海淀區樣品中的檢出率僅為8.8%和8.2%。上述結果表明，ASGV是侵染北京地區梨樹的最主要病毒種類，其次為ASPV和ASSVd，ACLSV的發生率相對較低，但在門頭溝區‘京白梨’品種上發生普遍。

本研究在所調查的大多數果園中，對每一梨品種進行隨機抽樣檢測，由于同一果園相同品種的不同植株之間可能攜帶不同的病毒種類(圖2和表2)，因此對本次調查的大多數梨品種而言，分析這些品種間帶毒率的差異可能沒有太大的參考價值。但少數幾個梨主栽品種如‘京白梨’、‘翠冠’、‘玉露香’和‘黃冠’等所檢測的樣品數相對較多，故對這4個品種病毒和類病毒的發生情況進行了統計分析，結果見表4。由表可知，ASGV和ASPV是侵染‘翠冠’和‘玉露香’的主要病毒種類，而ACLSV和ASSVd沒有或極少檢出。‘黃冠’品種上病毒和類病毒的發生情況與‘翠冠’和‘玉露香’類似，只是ASSVd的檢出率相對較高。‘京白梨’則普遍感染了ASGV和ACLSV，同時ASPV和ASSVd的檢出率也分別達到43.1%和49.0%。這些結果表明，不同梨品種所感染的病毒種類存在明顯差異，且‘京白梨’感染病毒和類病毒的情況更為嚴重。

表3 北京地區梨樹病毒和類病毒發生情況分析Table 3 Occurrence of viruses and viroids in pear plants in Beijing

表4 4個梨主栽品種病毒和類病毒發生情況統計Table 4 Occurrence of viruses and viroids in four popular pear cultivars

2.3 北京地區梨樹上病毒和類病毒復合侵染情況

對北京地區梨樹樣品中病毒和類病毒復合侵染情況進行統計，結果見表5。在所檢測的157份樣品中，有24份樣品只檢出1種病毒或類病毒。其中18份樣品只檢出ASGV，4份樣品只檢測出ASPV，其他2份樣品分別只檢測出ACLSV和ASSVd。其余133份樣品則為多種病毒(包括類病毒)的復合侵染，占樣品總數的84.7%。其中受到ASGV+ASPV+ASSVd復合侵染的樣品數量最多，占所檢樣品數的25.5%；受到ASGV+ASPV或ASGV+ACLSV侵染的各有11.5%的樣品；各有10.2%的樣品分別感染了ASGV+ASPV+ACLSV+ASSVd或ASGV+ASSVd。此外，有5.8%、5.1%、2.5%和2.5%的樣品分別受ASGV+ACLSV+ASSVd、ASGV+ASPV+ACLSV、ASPV+ASSVd和ASPV+ACLSV的復合侵染。以上說明北京地區梨樹受到病毒復合侵染的現象遠比單一侵染的更普遍，該結果為北京地區梨病毒病防控提供了參考。

表5 北京地區梨樹病毒(類病毒)單一侵染和復合侵染情況Table 5 Occurrence of single and mixed infection in pear plants in Beijing

3 討 論

ASGV、ASPV和ACLSV是侵染梨樹的3種主要病毒種類，但這幾種病毒在不同國家或地區梨園中的發生率有明顯區別。如在主栽東方梨品種的韓國，ASGV是侵染該國梨樹的最主要病毒種類，檢出率為74.2%，其次為ASPV(34.8%)，而ACLSV則極少檢測到[10]；在拉脫維亞[11]和突尼斯[12]等主栽西洋梨品種的國家，ACLSV是最主要的病毒種類；在我國，楊蕊等[13]用RT-PCR檢測了天津地區的梨樹樣品，結果表明ACLSV(47.1%)的檢出率最高，其次為ASPV(11.4%)和ASSVd (10%)，而ASGV的檢出率只有8.6%。本研究結果顯示，ASGV是侵染北京地區梨樹的最主要病毒種類，檢出率高達91.1%，其次為ASPV(59.2%)，ACLSV的檢出率(35.7%)相對較低。本研究檢測的梨樹樣品數為157份，涉及‘京白梨’、‘鴨梨’、‘園黃梨’、‘豐水梨’、‘玉露香’、‘黃冠’和 ‘翠冠’等51個栽培品種，而楊蕊等[14]檢測的梨樹樣品為70份，只涉及7個品種，樣本數量可能是導致調查結果出現差異的原因。這表明了今后需開展全國范圍內的廣泛和系統的調查，以摸清我國梨樹病毒和類病毒的發生情況。

北京地區梨樹樣品中ASSVd的檢出率高達54.8%，該數值明顯高于韓國[10]、波黑[14]和希臘[15]等國報道的數據。雖然目前尚未系統研究ASSVd對梨品種果實的危害，但是已有研究表明ASSVd可導致梨品種‘Niitaka’的果實出現明顯的凹果(Dimpling)病癥, 嚴重影響梨果品質[16]。因此鑒于ASSVd對梨果實的潛在危害，在北京地區進行梨樹苗木繁育和調運過程中，相關部門需加強對ASSVd的檢測。

本研究發現所有檢測的樣品均受到病毒侵染，而且有84.7%的梨樹樣品受到多種病毒(包括類病毒)的復合侵染，該數值顯著高于世界上其他國家如拉脫維亞[11]和突尼斯[12]等國家報道的數據。在以后的工作中，需要進行更多梨樹品種和數量的病毒攜帶情況調查，從而為苗木生產和繁育提供數據支持和指導。

本研究結果表明‘京白梨’、‘翠冠’、‘玉露香’和‘黃冠’等不同梨品種所攜帶的病毒種類各不相同，這與Pūpola等[11]報道一致。需要引起重視的是，本研究通過對門頭溝區4個果園單一栽培品種(‘京白梨’)的廣泛調查發現，即使是同一果園同一品種的不同梨樹，所感染的病毒種類也存在著明顯差異。由于無法得知這些果園接穗和砧木的來源及其當時帶毒情況，目前尚不清楚造成這種結果的確切原因。有報道表明，蘋果和梨種子也是傳播病毒(類病毒)的途徑之一[17-20]，因此推測砧木(杜梨實生苗)帶毒可能是同一果園內的不同‘京白梨’樹感染不同病毒種類的原因；另一個原因可能是‘京白梨’接穗來源不同而攜帶不同病毒種類所致。在以后的研究中，需要對更多果園中其它梨品種的不同植株進行病毒和類病毒檢測，以分析這種現象是否具有普遍性。

4 結 論

針對北京市重要梨果生產區的157份樣品進行ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd檢測，發現北京地區梨樹普遍受到病毒和類病毒的復合侵染。其中ASGV+ASPV+ASSVd復合侵染率最高。侵染北京地區梨樹的最主要病毒種類是ASGV。