杜梨組培苗兩步生根技術體系優化

趙亞楠 張 懿 譚 旭 王勝男 姜 峰 李天忠 朱元娣

(中國農業大學 園藝學院，北京 100193)

杜梨(PyrusbetulifoliaBunge)屬薔薇科(Rosaceae)梨屬(PyrusL.)多年生落葉喬木，是我國北方地區梨樹的優良砧木，用杜梨嫁接的梨樹具有適應性強、耐鹽堿、抗寒、抗旱、根系發達、生長速度快和能保持梨品種原有風味不變等優點[1]。杜梨以播種繁殖為主，實生后代遺傳變異性大[2]，影響接穗品種的生長勢和早熟性。目前，杜梨無性系繁殖主要包括扦插和組織培養[3-4]。與扦插繁殖相比，組培繁殖不受季節限制，良好的微繁殖技術體系一旦建立，種苗繁殖系數高，是無病毒種苗繁育的必經之路，亦是果樹種苗工廠化生產的有效途徑[5]。

梨離體繁殖技術始于20世紀后期[6-8]，國外最早報道見于1979年梨砧木OH×F51[7]和‘巴梨’品種[8]，同期在國內開始‘錦豐’和‘早酥梨’的莖尖培養[9]。至今已建立‘庫爾勒香梨’[10]、‘京白梨’[11]、‘津香蜜’和‘巴梨’[12]等多個梨品種和梨矮化中間砧S2、S5和PDR54[13]等砧木的組培繁殖體系。組培繁殖體系包括無菌外植體建立、啟動培養、增殖培養和馴化移栽4個環節。試管苗生根移栽是組培繁殖的關鍵技術，生根質量影響移栽的成活率[14]。梨組培苗離體生根能力除受外植體基因型、繼代次數[4]和組培苗生長狀態等因素影響以外，還取決于生根誘導方式、培養基成分和培養條件等因素[15]。“兩步生根法”多用于難生根的果樹材料，如櫻桃[16]、梨[17]和桃[18]等。梨不同基因型需要不同的生根誘導培養基。西洋梨在MS(Murashige & Skoog)培養基上比在QL(Quoirin & Lepoivre Medium)培養基容易生根[19]，梨矮化砧木S2、S5和PRD54生根的基礎培養基分別以1/2QL、1/2MS和1/4MS為佳[13]。生長素類物質是梨組培苗生根誘導的主要生長調節劑，常用的生長素有吲哚乙酸 (IAA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)，不同品種植物適宜的生長素種類和濃度不同[20]，常以不同生長素組合來誘導梨不定根的發生[21]。組培苗馴化移栽是梨繁殖的關鍵環節，不同煉苗方式影響試管苗移栽成活率。未經馴化將組培苗直接移植于田間，組培苗的成活率很低[22]。目前梨組培苗常用的馴化煉苗方法是先閉瓶煉苗再開瓶煉苗[23]。水培煉苗也是一種常見的煉苗方式，其方法是將組培苗置入改良的霍格蘭德(Hoagland)營養液中，室內水培馴化，該方法極大地提高蘋果和葡萄試管苗移栽成活率[24-25]。

果樹無性系砧木是現代果園生產的基礎，蘋果、西洋梨和櫻桃等無性系砧木在歐美國家廣泛應用[26-28]。我國新建果園逐步采用蘋果和櫻桃無性系，但梨無性系砧木應用少，梨試管苗生根誘導和馴化移栽體系有待優化[5]。本研究以杜梨組培苗為試材，研究培養過程中MS、1/2MS、木本植物用培養基 (WPM)和NN69(Nitsch & Nitsch Medium)基本培養基對杜梨生根、不定根誘導階段的最適激素配方以及閉瓶煉苗和水培煉苗對杜梨生長的影響，旨在解決杜梨組培苗生根率和移栽成活率低的問題，以期為梨組培技術的商品化應用和優質種苗生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物材料為課題組保存的杜梨組培苗。選取繼代培養40～60 d，2.5 cm≤高度≤4.0 cm，粗度≥2 mm，生長健壯的杜梨組培苗進行生根誘導試驗。

1.2 試驗方法

參照劉永富[3]的暗培養結合“兩步生根法”進行杜梨組培苗生根培養。第一步誘導不定根原基，選用健壯組培苗，接種在含有單一生長素或2種生長素組合的培養基上，暗培養7 d；第二步誘導不定根生長，將組培苗轉接于不含生長素的相同培養基上，光照培養，采用混合光(紅∶藍∶白=3∶1∶1)，光照強度為2 000～2 500 lx，光周期為14 h/10 h，溫度為(25±2) ℃，濕度為40%～50%。

光照培養30 d后，統計杜梨組培苗的生根率和根長≥1 mm的生根數。生根率=生根株數/接種株數×100%；平均生根數=生根條數/生根株數。

1.2.1不定根原基誘導的激素配方設置

以添加15 g/L蔗糖的1/2MS培養基為基礎培養基，設置4種激素配方誘導不定根的發生：(A)添加IAA 1.0 mg/L；(B)添加IBA 1.0 mg/ L；(C)添加IAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L；(D)添加IAA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。采用去除生長素的相同培養基進行不定根生長培養。各處理接種15株，重復3次。

1.2.2生根誘導的基本培養基

以1.2.1中確定的適合杜梨組培苗不定根誘導的激素配方和15 g/L蔗糖為基準，將MS、1/2MS、WPM和NN694種培養基交叉組合，分別進行不定根誘導和不定根生長培養，共設計16種處理(標記為1～16)。各處理接種9株，重復3次。

1.2.3試管苗的馴化移栽

在杜梨組培苗生根30 d后，采用2種方式煉苗。閉瓶煉苗方法是將生根的試管苗移至溫室內，閉瓶煉苗3周，在移栽前1 d擰松瓶蓋，但不拿掉瓶蓋。水培煉苗參照謝璇等[24]的方法，將生根的試管苗從組培瓶中取出，洗去培養基，置于改良Hoagland半營養液中水培3周，每周更換1次營養液。

煉苗3周的試管苗在溫室中移栽。按照V(營養土)∶V(草炭)∶V(蛭石)=2∶1∶1配制栽培基質，用800～1 000倍多菌靈溶液進行基質殺菌，基質濕度80%左右。移栽后，立即覆膜保濕。移栽2周后逐漸進行通風降濕，待組培苗葉片不再萎蔫時完全去除覆蓋材料。

1.3 數據分析

使用Microsoft Excel 2010軟件進行數據整理，使用IBM SPSS Statistics 21軟件進行顯著性分析，采用Duncan新復極差法進行多重比較，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 杜梨組培苗不定根原基誘導的激素配方

“兩步生根法”的不定根誘導階段使用不同的生長素配方對杜梨組培苗生根的影響顯著，結果如表1 所示。單獨添加IAA的培養基中，組培苗的愈傷組織少(圖1(b))，少數植株生根，生根率為(8±7)%，平均生根數為(1.00±1.00)條；單獨添加IBA的培養基中，組培苗的愈傷組織較少(圖1(c))，生根率為(84±6)%，平均生根數為(2.39±0.09)條；IAA和IBA組合中組培苗產生的愈傷組織較多(圖1(d))，生根效果較差，生根率為(67±11)%，平均生根數為(2.90±0.68)條；IAA和NAA組合中組培苗愈傷組織較少(圖1(e))，生根效果最好，生根率為(90±2)%，平均生根數為(3.58±0.89)條。綜上，在4種激素配方中，IAA 1.0 mg/L和NAA 1.0 mg/L 2種生長素組合最適合在根原基誘導階段對杜梨組培苗進行生根誘導。

表1 不同生長素配方對杜梨離體生根的影響Table 1 Effect of different auxins combination on in vitro rooting of Pyrus betulifolia

(a)生根誘導的健壯組培苗；(b)吲哚乙酸1.0 mg/L；(c)吲哚丁酸1.0 mg/L；(d)吲哚乙酸1.0 mg/L+吲哚丁酸1.0 mg/L；(e)吲哚乙酸1.0 mg/L+萘乙酸1.0 mg/L(a) Robust shoots used for rooting induction; (b) IAA 1.0 mg/L； (c) IBA 1.0 mg/L； (d) IAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L； (e) IAA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L圖1 不同生長素配方對杜梨離體生根的影響Fig.1 Effects of different auxins combination on in vitro rooting of Pyrus betulifolia

2.2 杜梨組培苗生根誘導的基本培養基篩選

不同基本培養基組合對杜梨組培苗生根的影響顯著。將MS、1/2MS、WPM和NN694種培養基交叉組合后的生根情況如表2所示。處理1即不定根根原基誘導階段和不定根生長階段都采用MS培養基的生根率和生根數最低，分別為(52±17)%和(1.52±0.43)條，與其他處理組差異較大，說明MS培養基不適宜杜梨組培苗的生根；處理16即兩階段都采用NN69培養基的生根率和生根數最高，分別為(96±6)%和(3.28±0.28)條，杜梨組培苗生根快且根數多，生根效果最好。因此，在4種供試基本培養基中，NN69是最適合杜梨組培苗生根的基礎培養基。

表2 不同基本培養基對杜梨離體生根的影響Table 2 Effect of different basic media on in vitro rooting of P.betulifolia

(a)～(d)分別代表第一步使用MS、1/2MS、WPM和NN69培養基，第二步采用NN69培養基的生根狀態。(a)- (d) The rooting status was represented by MS, 1/2MS, WPM and NN69 medium in the first step and NN69medium in the second step, respectively.圖2 杜梨在不同基本培養基上的離體生根狀態Fig.2 In vitro rooting status of P.betulifolia on different basic media

2.3 不同煉苗方式對杜梨組培苗生長的影響

杜梨組培苗生根30 d后，進行閉瓶煉苗和水培煉苗3周。組培苗皆有葉片變大，葉色變綠，莖木質化程度提高的現象。閉瓶煉苗中組培苗根長略有增加，無新根發生(圖3(c))；水培煉苗中約一半植株有新根或側根發生(圖3(e))。

(a)閉瓶煉苗；(b)水培煉苗；(c)閉瓶練苗后杜梨組培苗的生長狀態；(d)水培練苗前的杜梨組培苗的生長狀態；(e)水培練苗后的杜梨組培苗的生長狀態。(a) Plantlet hardening in closed jars; (b) Plantlet hardening in hydroponic culture; (c)The growth state of in vitro plantlets of P.betulifolia after hardened in closed jars; (d) The growth state of in vitro plantlets of P.betulifolia before hardened in hydroponic culture; (e) The growth state of in vitro plantlets of P.betulifolia after hardened in hydroponic culture.圖3 閉瓶煉苗與水培煉苗對杜梨組培苗生長的影響Fig.3 Effects of plantlet hardening in closed jars and hydroponic culture on the growth status of in vitro plantlets of P.betulifolia

杜梨組培苗閉瓶煉苗后移栽163株，移栽1個月成活149株，成活率為91.4%；水培煉苗后移栽94株，1個月后成活85株，成活率90.4%。杜梨組培苗以閉瓶煉苗和水培煉苗方式進行煉苗后的移栽成活率沒有明顯差異，皆達到90%以上。與水培煉苗相比，閉瓶煉苗適用于大規模的生產應用。綜合杜梨組培苗生根培養和馴化移栽的關鍵技術，建立了杜梨組培苗快速出苗技術流程(圖4)。

3 討 論

圖4 杜梨試管苗快速出苗技術流程圖Fig.4 The flow chart of the rapid propagation technique of in vitro cultured P.betulifolia

植物組培苗生根誘導過程中，低糖低鹽培養基有利于多數植物試管苗生根。蔗糖濃度不適會引起異養無根苗的饑餓或滲透壓低于或超出最適水平從而不利于生根，低鹽培養基可能是因為培養基中的氮源降低到了一個有利水平而有利于試管苗生根[15]。本研究發現，低鹽培養基1/2 MS、WPM和NN69比高鹽培養基MS適合杜梨組培苗的生根培養，又以NN69的生根效果最好，可能因為NN69培養基的成分更適合杜梨組培苗不定根的生長。生長素類物質是梨微繁殖中不定根誘導所必需的，常用IAA、IBA和NAA誘導生根。IAA在根原基誘導階段起著至關重要的作用，王金祥等[29]通過測量根原基誘導階段IAA含量升高，而生根后IAA含量下降，證明IAA是啟動不定根形成的重要因子。IBA比IAA穩定，它可以刺激嫩葉和嫩芽形成的IAA運至基部，從而促進生根，也可以在輔酶的作用下轉化成為IAA發揮作用[29-30]。NAA不直接參與根的形成，它可以促進組培苗儲存的淀粉水解成為還原糖，有利于不定根的形成，但是NAA濃度過高誘導的愈傷組織過大，不利于后期的移栽成活[31]。生長素單一使用或2種以上混合使用，對不同品種梨生根的作用不同。本研究中，杜梨組培苗單獨使用1.0 mg/L IBA的生根效果較好，與已有報道中IBA誘導梨組培苗生根的結果一致[20]，但IAA和IBA各1.0 mg/L混合處理，卻抑制了杜梨組培苗生根。使用1.0 mg/L IAA和1.0 mg/L NAA的組合時，杜梨組培苗的生根率和生根數最高，說明合適的生長素組合共同誘導杜梨組培苗生根效果優于單一生長素處理。不定根誘導過程中暗培養時間受繁殖體生長狀態、繼代繁殖次數和培養環境等因素影響。本研究選擇暗培養7 d，產生的愈傷組織不影響組培苗的生根和移栽成活率。短時間暗培養如2 d不利于杜梨生根[3]。

除了通過優化生根過程來提高組培苗的生根率和生根數以外，合適的煉苗方法也是提高組培苗移栽成活率的重要措施[19]。梨的煉苗是通過不斷降低濕度完成的[32]。本研究采用閉瓶煉苗和水培煉苗2種方式，組培苗地上部分生長狀態相似，但水培煉苗的根系發育優于閉瓶煉苗，這與在蘋果[24]、葡萄[25]和香蕉[33]上的研究結果一致。水培煉苗可以提高移栽后香蕉苗的根系活力和光合效率，加快植株生長[33]，故水培煉苗是否會對杜梨組培苗的后續生長產生有益影響，有待進一步研究。梨組培苗常用的煉苗方法是先閉瓶煉苗再開瓶煉苗，閉瓶煉苗主要是增強葉片對光照強度的適應性，開瓶煉苗能進一步提高葉片對濕度降低引起的水分脅迫的適應性[29]。因為杜梨組培苗極易失水萎蔫，所以本研究中直接采用閉瓶煉苗，移栽后立即覆膜保濕，杜梨組培苗易成活。本研究采用2種方式煉苗3周后，杜梨組培苗的移栽成活率沒有明顯差異，這可能與組培苗的生長狀態有關。當組培苗足夠健壯，根系質量好，無論采用何種煉苗方式皆能獲得較高的移栽成活率，而閉瓶煉苗更易于生產應用。

4 結 論

本研究通過對杜梨組培苗培養過程中培養基配方的篩選發現“低鹽低糖高濃度生長素的培養基+暗培養”誘導不定根發生和“低鹽低糖無激素培養基+光照培養”促進不定根生長的“兩步生根法”適宜杜梨組培苗生根培養。馴化移栽過程中通過對閉瓶煉苗和水培煉苗2種方式的比較分析發現，閉瓶煉苗3周后以V(營養土)∶V(草炭)∶V(蛭石)=2∶1∶1為栽培基質，移栽溫室后馴化1個月組培苗成活率達90%以上。