一株犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因組測(cè)序與其遺傳變異分析

劉子寧 魏 津 湯新明 梁 琳 崔尚金*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)北京科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，北京 100193；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus, CPIV)為副粘病毒科(Paramyxoviridae)，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)病毒，屬副流感病毒5型(Parainfluenza virus type 5,PIV5)。CPIV與其他病原混合感染引起犬傳染性呼吸道病(Canine infectious respiratory disease,CIRD)，又稱犬傳染性氣管支氣管炎，常發(fā)生于飼養(yǎng)環(huán)境擁擠密集的犬舍，且易反復(fù)爆發(fā)，難以根除；常引起整窩幼犬的集體感染，俗稱“犬窩咳”[1]。近年來我國犬窩咳發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其中CPIV的血清抗體陽性率可達(dá)30%～70%[2-3]。目前國內(nèi)尚無針對(duì)CIRD的疫苗上市，僅有部分弱毒聯(lián)苗包含CPIV[4]，且國外研究指出現(xiàn)有的商業(yè)CIRD疫苗均不具備高效的免疫保護(hù)力[1]，這可能與CPIV入侵宿主的過程不易受特異性抗體的影響有關(guān)[5]，因此，闡明CPIV致病機(jī)理、研發(fā)安全高效的疫苗需求迫切。另一方面，CPIV作為CIRD最主要的一種病原之一，具有感染性強(qiáng)但致病力弱、安全性高、基因組穩(wěn)定、激發(fā)免疫應(yīng)答全面等優(yōu)點(diǎn)，所以通過構(gòu)建感染性克隆平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)CPIV基因組的改造，具有作為CIRD或其他犬類疫病疫苗載體的潛能。綜上，獲得CPIV的基因組序列是開展CPIV致病機(jī)制等基礎(chǔ)研究和疫苗及疫苗載體研制等應(yīng)用研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著先進(jìn)理論和技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，解析毒株的遺傳背景和演化關(guān)系是借助分子生物學(xué)等技術(shù)研制安全高效疫苗的前提與基礎(chǔ)。但是由于PIV5并非人畜共患病，國內(nèi)外針對(duì)CIRD的研究多以其流行病學(xué)和臨床特征為主，對(duì)其病原的分子生物學(xué)研究還較少，現(xiàn)階段GenBank發(fā)布的CPIV全基因組數(shù)據(jù)較少，僅有9株，年代也較為久遠(yuǎn)，且其中僅有兩株來源于中國，中國流行毒株的基因組數(shù)據(jù)信息還需不斷完善。

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)具有呼吸道癥狀的病犬肺臟組織進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，從感染CPIV的肺臟組織中分離得到了一株CPIV，命名為CPIV-BJ01，但尚未對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序。本研究旨在了解CPIV-BJ01的全基因組序列特征，以期進(jìn)一步完善和豐富中國CPIV流行株的基因組信息，為后續(xù)CPIV的致病機(jī)制、診斷和疫苗的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)還可用于構(gòu)建CPIV感染性克隆平臺(tái)，為進(jìn)一步探究CPIV-BJ01全基因組中的突變對(duì)該毒株致病力及免疫原性等的影響提供可靠的科學(xué)平臺(tái)，從而為探索CPIV-BJ01作為疫苗載體的研制及犬傳染性呼吸道病等犬病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細(xì)胞、菌株和試劑

犬副流感病毒CPIV-BJ01株由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存[6]； Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存、傳代；Trans T1感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-Blunt載體，均購自北京全式金生物科技有限公司；PrimerStar Max Mix高保真酶購自TAKARA Bio INC；病毒總RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；cDNA一步式反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

采用分段擴(kuò)增的策略對(duì)CPIV-BJ01的基因組進(jìn)行擴(kuò)增(圖1)。依據(jù)GenBank中PIV5 1 168-1(登錄號(hào)：KC237064.1)全基因組序列設(shè)計(jì)6對(duì)引物(表1)，對(duì)CPIV-BJ01進(jìn)行分段RT-PCR擴(kuò)增。

圖1 CPIV-BJ01全長分段策略Fig.1 The strategy of complete genome segmentation of CPIV-BJ01

表1 CPIV-BJ01分段RT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design of of CPIV-BJ01 segmented RT-PCR

1.3 CPIV-BJ01的傳代培養(yǎng)

取細(xì)胞狀態(tài)良好、剛鋪滿至單層的Vero細(xì)胞，加入200 μL CPIV-BJ01病毒液，37 ℃感作1 h，然后加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于5% CO2恒溫(37 ℃)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每12 h觀察一次細(xì)胞病變情況，出現(xiàn)80%的細(xì)胞病變時(shí)收集病毒液，重復(fù)上述步驟，完成病毒的傳代。

1.4 CPIV-BJ01全基因組擴(kuò)增

取第四代病毒液提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，對(duì)各片段(圖1)進(jìn)行梯度RT-PCR擴(kuò)增，取小于引物Tm值5 ℃內(nèi)數(shù)值作為退火溫度梯度，確定最適反應(yīng)條件。20 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性30 s，低于Tm值1～2 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 45 s(目的片段>3 kb)或1 min 30 s(目的片段<3 kb)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。回收與預(yù)測(cè)大小一致的目的片段，連接至pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化后，對(duì)陽性菌液進(jìn)行測(cè)序。

1.5 全基因組序列分析

分段測(cè)序結(jié)果用DNAstar SeqMan軟件進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果由MEGA7軟件與GenBank發(fā)布的27株P(guān)IV5參考毒株(表2)進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的相似性比對(duì)，繪制其全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹及F、HN和SH基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPIV-BJ01感染Vero細(xì)胞的細(xì)胞病變

Vero細(xì)胞接種200 μL 105.5TCID50/0.1 mL CPIV-BJ01病毒液48 h后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，至72 h 出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，可觀察到接毒Vero細(xì)胞發(fā)生脫落、變圓、堆聚和拉絲等(圖2(a))。正常細(xì)胞在72 h內(nèi)貼壁生長，形成致密單層，生長速度也較接毒細(xì)胞快(圖2(b))。

2.2 分段獲得CPIV-BJ01全基因組序列

以CPIV-BJ01 cDNA為模板，分別以6對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增所得目的條帶分別為2 051、3 023、2 816、3 130、3 047 和2 576 bp(圖3)，與預(yù)期條帶大小一致。

2.3 CPIV-BJ01全基因組序列分析

2.3.1CPIV-BJ01全基因組序列拼接

CPIV-BJ01株全基因組分段測(cè)序正確的片段用SeqMan軟件拼接。結(jié)果顯示CPIV-BJ01基因組全長為15 246 bp，核苷酸數(shù)目為6的倍數(shù)，遵循“六堿基原則”，基因組序列包括3′-UTR、NP、V/P、M、F、SH、HN、L和5′-UTR，基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白序列符合預(yù)期的副流感病毒典型特征[7-8]。結(jié)果表明，成功獲得了CPIV-BJ01的基因組序列，為后續(xù)遺傳變異分析奠定了基礎(chǔ)。

表2 27株P(guān)IV5參考毒株信息Table 2 Information of 27 PIV5 reference strains

圖2 CPIV-BJ01對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)Fig.2 Cytopathic effect of CPIV-BJ01 on Vero cell

F1～F6：CPIV-BJ01全長基因組的1～6片段。F1-F6: 1-6 fragements of the complete genome of CPIV-BJ01.圖3 CPIV-BJ01全基因組分段RT-PCR擴(kuò)增Fig.3 Segmentation RT-PCR of complete genome of CPIV-BJ01

2.3.2CPIV-BJ01全基因組相似性分析

將CPIV-BJ01株全基因組序列與GenBank發(fā)布的27株P(guān)IV5參考毒株進(jìn)行比對(duì)，其核苷酸相似性為96.8%～99.9%，氨基酸相似性為92.3%～99.8%，表明CPIV-BJ01全基因組與參考毒株具有同源性。其中與1 168-1(KC237064.1)相似性最高，核苷酸相似性為99.9%，氨基酸相似性為99.8%；與T434(MK423237.1)相似性最低，核苷酸相似性為96.8%，氨基酸相似性為92.3%。CPIV-BJ01與其他參考毒株均不一致的特有突變?yōu)? 265位核苷酸由G變?yōu)锳，位于F基因內(nèi)，對(duì)應(yīng)氨基酸由A變?yōu)門；6 467位核苷酸由C變?yōu)锳，為非編碼區(qū)核苷酸；7 922位核苷酸由G或A變?yōu)镃，位于HN基因內(nèi)，對(duì)應(yīng)氨基酸由A或S變?yōu)镠；15 220位核苷酸由A或T變?yōu)镃，位于5′UTR內(nèi)。

2.3.3CPIV-BJ01全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

繪制CPIV-BJ01株與27株P(guān)IV5參考毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，CPIV-BJ01與犬源PIV5 1 168-1 分支最接近，與豬源PIV5 SH/2015/1202(MK028670.1)、虎源Mammalian rubulavirus 5(KY685075.1)、小熊貓?jiān)碢IV5 ZJQ-221(KX100034.1)、虎源PIV5 HMZ(MH370862.1)、穿山甲源PIV5 GD18(MG921602)、豬源PIV5 CAN(MH362816.1)位于同一分支內(nèi)(圖4)。

圖4 CPIV-BJ01全長序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of complete genome sequence of CPIV-BJ01

2.4 CPIV F基因及HN基因序列分析

2.4.1CPIVF基因及HN基因相似性分析

將CPIV-BJ01株與27株P(guān)IV5參考毒株的F和HN基因進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其F和HN基因與參考毒株具有同源性。其中CPIV-BJ01與1 168-1F和HN基因相似性最高，核苷酸相似性分別為99.9%和99.8%，氨基酸相似性均為99.6%；與T434F基因核苷酸相似性最低，為96.0%；與XJ033HN基因核苷酸和氨基酸相似性最低，分別為97.0%和96.6%；與N163(MK423243.1)HN基因氨基酸相似性最低，為95.1%。繪制進(jìn)化樹結(jié)果表明，CPIV-BJ01F和HN基因同全基因組的進(jìn)化關(guān)系保持一致，CPIV-BJ01均與1 168-1、SH/2015/1202、Mammalian rubulavirus 5、ZJQ-221、HMZ、GD18、CAN位于同一演化分支。

2.4.2F蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過與參考序列相似性比對(duì)結(jié)果得知，CPIV-BJ01F基因第736位核苷酸由G突變?yōu)锳，為該毒株的特有突變，該位點(diǎn)氨基酸由A變?yōu)門。通過YinOYang 1.2 糖基化軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該處突變引起CPIV-BJ01在245位氨基酸處比相似性最高的1 168-1毒株增加了一處O-糖基化位點(diǎn)，未增加N-糖基化位點(diǎn)(圖5)。

2.5 CPIV SH基因序列分析

PIV5SH基因CDS區(qū)位于第6 303～6 437位堿基，27株參考毒株的全基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)僅19個(gè)毒株在該區(qū)域有ATG起始密碼子，KUN-11、China/HB01/2019、Rigel、CC-14、PV-BC14、SER、CPI+、CPI-不具有SH基因。將CPIV-BJ01SH基因與19株參考毒株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CPIV-BJ01SH基因與全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹中位于同一演化分支的7個(gè)毒株的相似性均為100%，具有完全同源性；而與其他演化分支毒株的核苷酸相似性最高為97.0%，最低僅84.4%，氨基酸相似性最高為95.6%，最低僅31.8%，顯著低于全基因組、HN和F基因的比對(duì)結(jié)果，證明CPIV-BJ01SH基因與這些參考毒株僅部分同源或無同源性。繪制進(jìn)化樹結(jié)果表明了CPIV-BJ01與1 168-1、SH/2015/1 202、Mammalian rubulavirus 5、ZJQ-221、HMZ、GD18、CAN遺傳演化關(guān)系的密切性(圖6)。

圖5 CPIV-BJ01 F蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.5 Glycosylation site prediction of CPIV-BJ01 F protein

圖6 CPIV-BJ01 SH基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of SH genome sequence of CPIV-BJ01

3 討 論

CIRD是一種由多種病原體相繼或協(xié)同作用引起的高度接觸性傳染病，其致病病原除CPIV外，還包括犬腺病毒2型(CAV-2)、犬皰疹病毒1型(CHV-1)和支氣管敗血波氏桿菌(Bb)等多種病毒、細(xì)菌和支原體[9]。因此，CPIV在病原分離過程中需進(jìn)行多重篩選。本研究選用去除支原體，經(jīng)多重PCR檢測(cè)僅含有CPIV的病毒液，通過RT-PCR獲得全長基因組序列。該序列與GenBank發(fā)布的來自不同國家、不同分離時(shí)間和不同宿主來源的27個(gè)有代表性的PIV5毒株比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CPIV-BJ01全基因組與2009年在韓國分離到的犬源PIV5 1 168-1[10]相似性高達(dá)99.9%，與2016年韓國分離到的豬源PIV5 T434相似性最低，為96.8%。與CPIV-BJ01在系統(tǒng)進(jìn)化樹中位于同一演化支、核苷酸相似性在99.7%以上的PIV5毒株來源于多個(gè)不同的宿主，該結(jié)果與PIV5宿主來源多樣且基因組無宿主特異性[11-12]的報(bào)道一致，證明其具有開發(fā)作為通用疫苗載體的潛能。副黏病毒科病毒疫苗研究的主要關(guān)注點(diǎn)是包膜糖蛋白F、HN和SH[13]。CPIV-BJ01F基因和HN基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分支與全基因組進(jìn)化樹保持一致，表明F和HN基因在病毒演化過程中具有區(qū)分進(jìn)化分支的代表性。HN和F蛋白與CPIV進(jìn)入宿主細(xì)胞復(fù)制、傳播及其免疫原性密切相關(guān)，F(xiàn)-HN蛋白間可發(fā)生相互作用[14]，有報(bào)道稱HN蛋白部分氨基酸殘基的改變與病毒抵抗中和抗體的能力有關(guān)，同時(shí)也可改變F蛋白的活化程度從而對(duì)膜融合產(chǎn)生抑制作用[15]。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)CPIV-BJ01編碼區(qū)的兩處錯(cuò)義突變均位于F和HN基因內(nèi)，其中F基因內(nèi)氨基酸序列的改變使其增加了一處O-糖基化位點(diǎn)，為CPIV-BJ01所特有，糖基化修飾與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，但這些氨基酸改變對(duì)F蛋白的功能及F和HN蛋白相互作用的影響還有待進(jìn)一步研究。F基因在其他副黏病毒科病毒中常可作為區(qū)分毒株間差異的標(biāo)志[16]，也有PIV5F基因與其流行和進(jìn)化密切相關(guān)的報(bào)道[17]，但CPIV-BJ01與參考毒株F基因的相似性較高，證明CPIV遺傳進(jìn)化相對(duì)保守[18-19]。

此外，本研究還針對(duì)PIV5的第三種包膜糖蛋白SH基因進(jìn)行分析，該蛋白在某些PIV5中不存在[11,17]，CPIV-BJ01測(cè)序結(jié)果顯示具有SH基因，且與位于同一演化分支的其他7個(gè)PIV5毒株相似性均為100%，與其他演化分支毒株的核苷酸及氨基酸序列都差異較大，顯著低于其與全基因組和F、HN基因的相似性，氨基酸相似性最低可達(dá)31.8%。該結(jié)果證明SH基因可作為PIV5毒株間遺傳演化差異的分子標(biāo)記。值得注意的是，目前研究指出PIV5的SH基因具有抑制TNF-α分泌從而阻斷其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[20]，即擁有SH基因的毒株感染細(xì)胞通常不造成CPE，為病毒形成長程感染提供有利條件。但本研究發(fā)現(xiàn)CPIV-BJ01雖然具備SH基因但仍可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，證明CPIV-BJ01SH基因編碼的小疏水性蛋白無法完全行使其功能，敲除該基因CDS區(qū)直接替換為外源基因的可行性較高[21]，使CPIV-BJ01具有更大的作為疫苗載體的應(yīng)用潛能。

隨著我國養(yǎng)犬?dāng)?shù)量的逐年遞增，諸如CIRD這樣的尚無高效疫苗的犬類傳染病逐漸進(jìn)入人們的視線，開發(fā)基因工程犬類疫苗是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。CPIV是疫苗載體的可靠候選毒株，利用反向遺傳操作平臺(tái)可敲除或改造CPIV的毒力基因，將CIRD相關(guān)的其他病原抗原基因插入CPIV基因組，獲得安全的重組病毒而研制的疫苗，有望安全高效的實(shí)現(xiàn)一針防多種病原。本研究通過CPIV-BJ01全基因組測(cè)序與遺傳變異分析，明確CPIV-BJ01特有的核苷酸和氨基酸變化情況及糖基化修飾的改變，為CPIV-BJ01反向遺傳操作平臺(tái)的構(gòu)建提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探究CPIV-BJ01全基因組中的突變對(duì)該毒株致病力及免疫原性等的影響提供可靠的科學(xué)平臺(tái)，從而為探索CPIV-BJ01作為疫苗載體的研制及犬傳染性呼吸道病等犬病的防控奠定基礎(chǔ)。