辣木莖提取物對過氧化氫誘導的小鼠晶狀體渾濁度的影響*

鐘瑞生 徐清妍 朱曉燕 郭連春 林 媛

晶狀體是透明、彈性、無血管的光透射組織，在視覺形成中起著重要作用。白內障是世界范圍內視力損害和失明的主要原因，它的病理特征是伴有逐漸積聚在晶狀體上的渾濁沉積物?，F代白內障手術雖然安全有效，但仍存在成本高、術后眼功能喪失、后發性白內障發生率高等問題。隨著人口老齡化的加劇，白內障已成為一個日益嚴重的問題[1]。因此，開發安全、有效、經濟的預防或延緩白內障發病的藥物具有很大的臨床意義。

白內障的發生與多種危險因素有關，如年老、糖尿病、陽光照射和高血壓病等。然而，活性氧(ROS)引起的氧化應激一直被認為是細胞受損和形成白內障的主要機制。由于氧化應激在白內障形成中的重要作用，高活性、不良作用少的天然抗氧化劑在延緩白內障的發生或發展中的應用引起了越來越多的關注[2]。辣木樹(Moringa oleifera)又稱辣根樹或鼓槌樹(Drumstick tree)，屬于辣根科植物，在亞洲許多國家被用作營養食品和治療風濕、炎癥和糖尿病等各種疾病的傳統藥物。辣木分布廣泛并且富含天然抗氧化劑[3 ]。據報道，辣木葉提取物能抑制過氧化氫誘導的ROS形成，增強KB細胞和HEK-293細胞[4]中SOD和CAT的活性和mRNA的表達。最近發現辣木葉提取物通過降低細胞內ROS水平來保護酵母細胞免受鎘和H2O2誘導的氧化應激[5]。在飲食誘導的氧化應激大鼠模型中，通過攝入辣木葉提取物可降低大鼠脂質過氧化損傷并提高SOD和CAT的活性。辣木籽提取物能抑制高脂飲食誘導的小鼠ROS形成[6]。辣木根提取物可減輕鎘誘導的大鼠氧化應激損傷[7]。以上所有體內體外的研究證實辣木有顯著的抗氧化活性，提示辣木可能具有抑制氧化應激誘導的白內障形成的作用。雖然有研究報道[8]，辣木葉提取物對體外山羊晶狀體高糖性白內障和大鼠幼鼠亞硒酸性白內障有潛在的抑制作用，但對其在氧化應激導致的白內障中的保護作用研究還未見報道。

晶狀體器官培養為篩選預防白內障形成的候選化合物提供了一個簡單有效的手段[9]。過氧化氫(H2O2)是房水中主要的細胞內ROS，可以導致白內障發生，并經常用于體外誘導白內障形成。因此，本研究以體外過氧化氫誘導的白內障形成模型為基礎，探討辣木莖提取物(MOSE)對白內障形成的保護作用及其潛在機制。木犀草素是一種黃酮類化合物，存在于許多植物的葉和莖中，有報道表明木犀草素對亞硒酸鹽和STZ誘發的白內障具有保護作用[10]。因此，木犀草素可作為辣木莖抗氧化活性的陽性對照。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗使用體質量20～22 g雄性balb/c小鼠(證書編號：scxk 2012-0002；上海slac實驗動物有限公司，中國上海)。將小鼠置于控制溫度(22±1 ℃)下，光/暗循環12 h，允許自由獲取食物和水。

1.2 試劑培養基199(M-199)、胎牛血清(FBS)和抗生素溶液購自Gibco(美國紐約州大島)；2,2-二苯基-1-1-甲基肼(DPPH)、蘆丁和木犀草素從Sigma Aldrich(美國密蘇里州圣路易斯)購買；2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)和放射免疫測定(RIPA)裂解緩沖液購自Solarbio(中國北京)。其他使用的材料在以下章節中詳細說明。

1.3 MOSE的制備干辣根莖購自廈門金珠生態農業有限公司(廈門，福建，中國)。將干燥的辣木莖粉碎，用70%乙醇在85 ℃下提取2 h，然后用whatman濾紙過濾上清液，真空蒸發得到乙醇提取物MOSE。提取物凍干成粉末狀保存。在實驗中，將凍干的MOSE粉末用M-199稀釋，然后用0.22 μm的微濾膜過濾。

1.4 MOSE中總黃酮含量的測定用Na NO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定MOSE中總黃酮含量。將10 ml MOSE溶液(0.1 mg/ml，用100%乙醇稀釋)與1 ml 5%NaNO2混合，然后添加1 ml 10% Al(NO3)。5 min后，向混合物中添加5 ml 1 mmol/L NaOH。用60%乙醇將體積定容到25 ml，靜置15 min。在510 nm處測量吸光度。所有測定均一式3份。總黃酮含量以蘆丁當量/g MOSE干重表示。

1.5 晶狀體體外培養參照前人的方法[11]改良晶狀體體外培養方法。小鼠經二氧化碳處死后斷頭，通過后入路從眼睛分離晶狀體，轉移到含有4 ml M-199培養基、1%青霉素鏈霉素和2%胎牛血清的6孔板上。然后，將晶狀體在37 ℃ 的5%二氧化碳培養箱中培養。24 h后，在解剖顯微鏡下觀察每個晶狀體，并選擇透明晶狀體進一步實驗。經過挑選后的晶狀體分為以下組：正常對照組(在正常培養基中培養的晶狀體，不暴露于過氧化氫)；MOSE對照組(含MOSE培養基中培養的晶狀體，不暴露于過氧化氫)；模型對照組(在正常培養基中培養的晶狀體，暴露于過氧化氫)；MOSE(0.5 mg/ml)處理組(在過氧化氫暴露前在含0.5 mg/ml MOSE的培養基中培養的晶狀體)；MOSE(1 mg/ml)處理組(在過氧化氫暴露前在含1 mg/ml MOSE的培養基中培養的晶狀體)；木犀草素(0.05 mg/ml)處理組(在過氧化氫暴露前在含0.05 mg/ml木犀草素的培養基中培養晶狀體)。將晶狀體在培養基中培養24 h，然后用或不用1 mmol/L H2O2處理24 h，然后在新鮮培養基中再培養48 h。實驗結束時，在解剖顯微鏡下檢查每個晶狀體的形態變化，然后從培養皿中取出，小心地在濕濾紙上吸干，稱重，然后立即液氮速凍，留樣進行后續分析。

1.6 晶狀體渾濁度的測量每組(6只/組)在配有CCD攝像頭的解剖顯微鏡下檢查晶狀體的不透明度并拍照。根據前人的報告[12]，使用Image J軟件測量每個晶狀體的平均灰度值，計算與正常對照組晶狀體平均灰度的比值。

1.7 晶狀體ROS生成的測定根據前人報告的方法[13]稍加修改，使用DCFH-DA觀察晶狀體勻漿中細胞內氧化應激的直接證據。DCFH-DA熒光探針在ROS的作用下產生530 nm高度熒光的DCF。實驗結束時，用0.9%生理鹽水以1∶9的比例在玻璃勻漿器中勻漿晶狀體(每組6個)。為了測量活性氧的產生，將每個樣品的勻漿液(100 μl)與100 μl DCFH-DA(20 μm)混合在96孔板中，然后在37 ℃下避暗培養30 min。勻漿液在4 ℃下以3000 r/min離心，離心15 min，上清液用熒光分光光度計(488 nm激發，520 nm發射)測定熒光強度。計算結果為每毫克蛋白質的熒光強度，計算與正常對照組熒光強度的倍數變化。

1.8 晶狀體中GSH含量測定及抗氧化的酶(SOD和CAT)活性測定實驗結束后，用0.9%冷鹽水沖洗晶狀體，用濾紙干燥，稱重。然后，在玻璃勻漿器中以1∶9的比例用0.9%生理鹽水勻漿(每組6個)。將勻漿液在3000 r/min下于4 ℃離心15 min，收集上清液進行分析。采用試劑盒(中國南京建城生物工程研究所)測量GSH含量和總SOD和CAT活性。上清液中蛋白質含量用BCA試劑盒(中國北京阿普利根科技有限公司)測定。對于所有的分析，活性計算為對照組的相對倍數變化。

1.9 統計學方法每個實驗至少進行3次。結果表示為平均值±標準差(SEM)。統計分析采用單因素方差分析，然后使用Prism 5 Windows軟件(GraphPad軟件公司，加利福尼亞州圣地亞哥)進行Tukey的事后檢驗。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MOSE中總黃酮的含量用Na NO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定總黃酮含量。MOSE的黃酮含量為(169.7±3.015)mg蘆丁當量/g MOSE干重，即1 g MOSE黃酮的含量相當于169.7 mg蘆丁。

2.2 MOSE和木犀草素對晶狀體渾濁度的影響為了研究MOSE和木犀草素對晶狀體渾濁的影響，在體視顯微鏡下觀察H2O2誘導晶狀體渾濁的變化。正常對照組和MOSE預處理對照組中所有晶狀體都是透明的，但1 mmol/L H2O2顯著誘導致密的皮質空泡化和渾濁。用MOSE(0.5 mg/ml和1.0 mg/ml)預處理后，過氧化氫誘導的晶狀體渾濁水平顯著降低。在前期的實驗發現木犀草素作為對照也降低了晶狀體渾濁度，0.05 mg/ml木犀草素效果比0.1 mg/ml木犀草素更好。因此，在正式實驗中使用0.05 mg/ml木犀草素。見圖1。

注：數據用平均值±SEM(n=6)表示；與正常對照組相比，##P<0.01；與過氧化氫治療組相比，**P<0.01。圖1 MOSE和木犀草素對過氧化氫性導致的白內障晶狀體渾濁的影響

用MOSE(0.5 mg/ml和1.0 mg/ml)或木犀草素(0.05 mg/ml和0.1 mg/ml)預處理晶狀體24 h，然后用過氧化氫(1 mmol/L)孵育24 h，然后在新鮮培養基中恢復48 h。(圖1a)顯示不同處理條件下的晶狀體的代表性照片。(圖1b)晶狀體不透明度密度的定量。

2.3 MOSE和木犀草素對晶狀體ROS蓄積、GSH含量及SOD/CAT活性的影響為了研究MOSE是否能阻止H2O2誘導的ROS生成，用熒光探針DCFH-DA測定了晶狀體中ROS的含量。小鼠晶狀體中ROS的基礎水平為(16.41±1.018)(熒光強度/mg蛋白)，經1 mmol/L H2O2暴露24 h后，晶狀體組織中ROS水平增加到(50.88±3.66)(熒光強度/mg蛋白)，約為基礎水平的3倍。而MOSE(0.5 mg/ml和1 mg/ml)顯著降低了H2O2誘導的ROS產生(P<0.01)。作為對照，木犀草素也減少了晶狀體中ROS的產生。MOSE和木犀草素在抑制晶狀體ROS積聚方面差異沒有統計學意義。

為了研究MSOE抗氧化作用的機制，我們觀察了MOSE對GSH含量和參與ROS降解的一些抗氧化酶活性的影響。H2O2(1 mmol/L)顯著降低GSH含量，降低SOD和CAT活性。MOSE(0.5 mg/ml和1 mg/ml)能顯著提高H2O2處理后晶狀體中GSH含量和SOD活性(P<0.01)。此外，與對照組相比，MOSE顯著提高了晶狀體中CAT的活性，接近2倍。MOSE對GSH含量和抗氧化酶活性的影響遠大于木犀草素對晶狀體的影響。見圖2。

用熒光探針DCFH-DA檢測經MOSE(0.5 mg/ml和1.0 mg/ml)或木犀草素(0.05 mg/ml)預處理的在H2O2暴露前晶狀體的ROS水平。測定了經MES或木犀草素預處理的晶狀體在H2O2處理前的熒光強度(圖2a)、GSH含量(圖2b)、SOD(圖2c)和CAT(圖2d)活性。

2.4 MOSE和木犀草素對SOD、CAT表達的影響為了研究MOSE抗氧化活性的分子機制，測定了SOD和CAT的蛋白表達。用MOSE(1 mg/ml)預處理顯著增加了SOD和CAT的表達(P<0.01，圖3a，b，c)。木犀草素(0.05 mg/ml)也能提高SOD的表達，但對CAT的表達無影響。

用MOSE(0.5 mg/ml和1.0 mg/ml)或木犀草素(0.05 mg/ml)預處理晶狀體24 h，然后用過氧化氫(1 mm)孵育24 h，然后在新鮮培養基中恢復48 h，然后用western blot(圖3a)檢測蛋白表達。超氧化物歧化酶(圖3b)、CAT(圖3c)的免疫印跡定量研究。

3 討論

氧化應激在白內障形成中起重要作用，H2O2是導致白內障形成的主要氧化劑之一。本研究采用晶狀體離體培養技術，觀察MOSE對H2O2所致晶狀體渾濁的保護作用。盡管在不引起機械損傷的情況下從小鼠眼睛中獲取晶狀體是一項具有挑戰的技術，但晶狀體體外培養是評估候選化合物對白內障形成影響的一種簡單有效的方法。我們的研究表明，在含2%FBS的M-199培養基中，從小鼠眼睛分離出的整個晶狀體保持透明，并且在暴露于1 mmol/L H2O224 h后，所有無保護的晶狀體都變渾濁。MOSE(0.5 mg/ml和1.0 mg/ml)降低了晶狀體的渾濁度，且1 mg/ml MOSE比0.5 mg/ml MOSE更有效。已有研究表明，辣木對硒誘導的大鼠幼鼠的白內障有潛在的抑制作用，對高糖誘導的山羊體外晶狀體白內障有潛在的抑制作用[14]。我們的研究首次表明，在離體培養的晶狀體中，辣木副產品辣木莖的乙醇提取物也能有效地防止中細胞內主要活性氧過氧化氫(H2O2)誘導的白內障形成。

研究表明自由基可增加患白內障的風險。我們的結果表明，MOSE降低了無細胞體系中DPPH自由基的水平，并抑制了晶狀體中ROS的產生。然而我們也發現，盡管木犀草素對自由基的清除效果遠優于MOSE，但MOSE對白內障形成的抑制效果優于木犀草素。提示MOSE介導的抑制白內障形成的主要原因可能不單是直接抑制自由基的作用。MOSE還可調節細胞抗氧化系統防止白內障形成。我們的研究表明MOSE顯著地恢復了培養晶狀體中GSH的水平。人晶狀體中存在非酶和酶的內源性抗氧化系統。谷胱甘肽是一種高含量的內源性抗氧化劑[15,16]。它消除了超氧陰離子、H2O2和其他氧自由基。此外，GSH維持晶狀體蛋白質的還原狀態，防止蛋白質變性，并在維持晶狀體透明度方面發揮重要作用[17,18]。

此外，我們的研究表明，MOSE可以上調晶狀體在過氧化氫暴露后的SOD和CAT的活性和表達。超氧化物歧化酶催化超氧陰離子轉化為H2O2和氧。CAT催化H2O2轉化為水和氧，防止氧化損傷[ 19,20 ]。SOD和CAT屬于抗氧化系統，它將自由基轉化為毒性較小的狀態，并對氧化應激損傷起重要作用。這些結果與另一篇文章的結果相同，辣木葉提取物提高了H2O2處理的HEK-293細胞中一些抗氧化酶的mRNA表達水平。作為對照，木犀草素對內源性抗氧化防御的作用不如MOSE有效。一種可能的機制是辣木含有更多類型的抗氧化劑化合物，如抗壞血酸、類黃酮、酚類和類胡蘿卜素，這可能通過激活細胞抗氧化系統賦予更有效的保護。因此，MOSE可能是一種更具價值的預防白內障形成的提取物。