雞胚無殼孵化研究初報

杜金娥，董志岷，王 貴，劉 暢

（河套學院農學系，內蒙古 巴彥淖爾 015000）

無殼孵化是一項新穎且備受關注的人工孵化技術，是人工孵化領域的又一次突破。無殼孵化對于推動孵化科技及生命科學的進一步發展具有里程碑式的意義。雞胚發育過程清楚，尤其在雞胚發育早期絨毛尿囊膜階段，因其血管豐富，是天然的免疫缺陷宿主，常作為病理學、藥理學和腫瘤學等研究領域的理想實驗模型。有資料顯示，研究人員采取代用蛋殼孵化、窄窗口蛋殼整胚胎培養及人造容器培養的孵化率均較低，且使用代用蛋殼的培養方法有很多弊端，如不同批次代用蛋殼有差異，無法循環利用，胚胎操作過程中可操作性低等［1-2］。為了建立一種無殼孵化成功率較高的簡單培育方法，筆者使用方便的透明玻璃杯而不是代用蛋殼作為人工培養容器，在其中補充鈣和水，通入氧氣等，通過孵化期間剖視對照組種蛋的雞胚生長發育情況，并與試驗組同日齡無殼雞胚的生長發育情況作對比，及時調整試驗組孵化條件，以提高雞胚的無殼孵化率。

1 材料與方法

1.1 材料 種蛋：本試驗所用種蛋均為同一蛋雞舍所產的5 d 內新鮮種蛋，品種為紅波羅紅羽肉雞，又名紅寶，蛋重在55～60 g之間。

其他試劑及材料：青霉素鉀（400萬單位∕支），硫酸鏈霉素（100 萬單位∕支），兩性霉素B、乳酸鈣，新潔爾滅；聚甲基戊烯薄膜，透明玻璃杯，暖立方孵化器。

1.2 試驗設計 本試驗分對照組和試驗組兩組，兩組均選用同一品種、重量接近、新鮮度一致的種蛋各20 枚，所用孵化器型號相同，孵化條件一致。對照組種蛋經過消毒后直接放入孵化器孵化，試驗組種蛋經過消毒后先預孵化55 h再去殼放入人工培養容器中于孵化器內繼續孵化。

1.3 方法

1.3.1 無殼孵化時小環境的準備 將透明杯洗凈消毒，使用時用純化水沖洗，在透明杯下緣2 cm 的高度打孔，直徑為1.5～2 cm，孵化前期（第1～18 d）在洞口堵上棉絮作為過濾器，用一根直徑2 mm 的塑料管插入棉絮和洞之間的空隙提供氧氣，同時用于孵化至18 d以后注入氧氣使用，代替19 d雞胚啟用肺呼吸所需大量氧氣。然后在杯內注入青霉素鉀＋硫酸鏈霉素＋兩性霉素B抑菌水備用（如圖1）。

圖1 無殼雞胚人造培養容器示意圖

1.3.2 聚甲基戊烯薄膜的準備 用5%新潔爾滅消毒且晾干的種蛋在聚甲基戊烯薄膜上撐出蛋形（如圖2），并固定于注入抑菌水的透明杯內，用橡皮筋固定杯口，在有蛋形的聚甲基戊烯薄膜內加入乳酸鈣和純化水。

圖2 處理聚甲基戊烯薄膜示意圖

1.3.3 種蛋去殼后的孵化 在預孵化了50～55 h的種蛋鈍端劃線，用消毒過的剪刀尖扎眼兒，沿劃線剪2 cm 長的孔隙，輕輕將蛋液打入已加入乳酸鈣和純化水的聚甲基戊烯薄膜內。在聚甲基戊烯薄膜上方距離蛋液0.5 cm 處打8～10 個直徑約1 mm 的通風孔，代替蛋殼表面的氣孔，蓋上透明杯杯蓋（如圖3），放入孵化器開始孵化（如圖4）。

圖3 預孵化55 h的種蛋去殼效果圖

圖4 無殼雞胚放入孵化器入孵

1.3.4 雞胚死亡判定方法 雞胚心跳消失，血管顏色變暗，界限模糊，可判定雞胚死亡。

2 結果及分析

2.1 雞胚存活率情況 根據統計，對照組種蛋在第7～16 d 雞胚死亡率為5%，第17～18 d 死亡率又增加5個百分點；試驗組雞胚有兩個死亡高峰：第一個是在第7～10 d，死亡率為30%，第二個是集中在第16～18 d，死亡率在第一個死亡高峰的基礎上又增加50～70個百分點，直至第18 d時雞胚全部停止發育，存活數為0。

表1 不同胚齡的雞胚存活率

2.2 第3～7 d 出現死亡的原因分析 孵化至第3～7 d，對照組死亡率為5%，試驗組死亡率為0。此期正是胚胎生長迅速、形態變化顯著時期，各種胎膜相繼形成而功能尚未完善，對環境變化敏感，易導致胚胎夭折，是孵化過程中的第一個死亡高峰期。另外，種蛋貯存不當會降低胚胎活力，維生素A缺乏也會有重大影響。

2.3 第16～18 d 出現死亡的原因分析 第16～18 d，對照組死亡率為5%～10%，試驗組死亡率為75%～100%。此期是雞胚呼吸方式由尿囊呼吸轉向肺呼吸的關鍵時期，胚胎生理變化劇烈，需氧量劇增，自身產熱猛增，通風換氣不足而導致胚胎死亡，形成孵化過程中的第二個死亡高峰期。試驗組雞胚在此期沒有順利完成由尿囊呼吸向肺呼吸的轉變，吸入氧氣不足，故出現大量死亡。

3 提高無殼孵化率的因素分析

3.1 通風換氣 通風換氣是無殼孵化較難掌握的環節，氧氣、二氧化碳含量對孵化率都有明顯的影響，如氧氣含量在21%時孵化率最高，氧氣含量每升高1%，孵化率下降1%，氧氣含量每下降1%，孵化率下降5%。二氧化碳含量控制在0.5%以下對孵化率沒有明顯影響。因此，與蛋液直接接觸的聚甲基戊烯薄膜上氣孔直徑不能過大，數量不能過多，否則氧氣通入量過多，蛋液的蒸發速度高于雞胚對蛋液的吸收速度，蛋液變干而易導致雞胚死亡。

3.2 鈣的添加 對于雞胚來講，蛋殼具有保護雞胚防止外界細菌侵入蛋內的作用，另外，蛋殼的主要成分為碳酸鈣，可以為雞胚發育提供所需的鈣質。孵化至第11 d，雞胚開始從蛋殼中吸收鈣，第19 d 達到最高峰，因此雞胚中80%的鈣來源于蛋殼。為防止雞胚在發育過程中因缺鈣受到影響，或避免孵出的小雞出現畸形（如爪部彎曲，不能站立等），甚至出現存活率低下等問題，要在入孵前加入一定量的乳酸鈣來代替蛋殼中的鈣。

3.3 無菌操作 無殼孵化過程中由于雞胚脫離蛋殼，失去了蛋殼的保護，外界微生物極易侵入污染早期胚胎，因此去殼的過程需在超凈工作臺上進行。

3.4 轉蛋要求 轉蛋的目的是改變胚胎方位，防止胚胎粘連，使胚胎各部分均勻受熱，促進羊膜運動。本試驗使用的瑞科自動孵化器設定了轉蛋次數，孵化第1～18 d，每90 min轉蛋一次，轉蛋角度應與垂直線呈45°角。由于試驗組種蛋已去掉蛋殼，故轉蛋需人工操作，即在玻璃杯下方支一物體，使玻璃杯傾斜，且達到45°轉蛋角度，每隔90 min 反向轉至對側的同一位置。因雞胚失去蛋殼保護，故手動轉蛋時動作要輕，以防尿囊破裂造成雞胚發育中斷而死亡。

Assheton［3］、Perry［4］、Naito［5］、Ono［6］等人曾用不同人工培養容器培養雞胚，但是孵化率均較低。筆者使用透明聚甲基戊烯薄膜來孵化，不僅能從任何角度肉眼觀察胚胎的生長發育階段及其形態變化，而且只要拿走塑料蓋揭開薄膜就可以進行胚胎操作。目前，進一步提高無殼雞胚的孵化率是未來研究的重要方向，如果能獲得穩定的孵化率，將對胚胎操作具有很大的幫助，不但可用于再生醫學的基礎研究，也可以用于組織培養，鳥類胚胎干細胞的研究以及作為生物反應器雞蛋的批量生產。