聚果蜈蚣藻的修訂
——基于形態觀察、早期發育及分子序列分析

溫 馨 卞 瑤 張昕陶 馬 躍 王 晨 王宏偉

(1. 遼寧師范大學生命科學學院, 大連 116081; 2. 遼寧師范大學, 遼寧省植物生物技術重點實驗室, 大連 116081)

蜈蚣藻屬(GrateloupiaC. Agardh)是海膜科(Halymeniaceae)最大的屬, 在中國共報道了36個種[1—11],廣泛分布于我國暖溫帶、亞熱帶和熱帶沿海。該屬很多種外部形態差異很大, 種的區分和鑒定很困難。 《中國海藻志》 中記載的大部分蜈蚣藻屬海藻僅僅是依據外部形態所建立的新種, 很多種的分類地位還未確定。如今, 分子系統學的快速發展, 使得分子輔助的形態分類學(MAAT)逐漸興起, 該方法也逐漸地應用于紅藻分類研究上[12—14]: 2001年,Kawaguchi等[6]采用形態學和rbcL基因序列分析相結合的方法對產自意大利和亞洲的G. filicina(Lamouroux) C. Agardh進行了詳細研究, 發現二者在外部形態上雖具有一定的相似性但實際上是2個獨立的種, 并提出1新種, 命名為亞洲蜈蚣藻(G. asiaticaKawaguchi et Wang), 模式標本產地為日本福岡縣。李芳等[15]和劉芳等16]采用形態分類學的方法對李偉新等[1]基于形態學特征建立的2個新種帚狀蜈蚣藻(G. fastigiataLi et Ding)和對枝蜈蚣藻(G.didymecladiaLi et Ding)進行再鑒定, 發現這2個新種實際上分別是亞洲蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻(G.subpectinata)的同物異名。由此可見, 在藻類分類學的研究中, 分子分析手段的加入, 可以來驗證經典分類學的準確性, 為海藻分類學中已知種的鑒定提供了重要依據。

本研究的聚果蜈蚣藻(G. sorocarpusLi et Ding)記載于《中國海藻志》(2004)第二卷第三冊中[1],對該種的描述為: 藻體主枝較硬, 小羽枝一般密集在分枝中部, 小枝棍棒狀或扁平, 基部縊縮, 髓絲交接處呈啞鈴狀, 成熟囊果聚集在一起呈瘤狀, 是由李偉新等[1]基于囊果的形態及分布狀態等簡單的形態學特征對采自中國山東省青島市的雌配子體進行研究并建立的新種。為了驗證僅依據簡單的外部形態而提出的聚果蜈蚣藻的分類地位是否可靠,有必要對其形態、結構、孢子發育類型和基因序列分析進行詳細的研究, 將聚果蜈蚣藻的分類地位進行重新鑒定。研究結果將明確聚果蜈蚣藻的分類學地位, 為蜈蚣藻屬海藻的早期發育過程提供更詳細的信息并對中國的蜈蚣藻屬海藻的修訂和重新分類提供有力依據。

1 材料與方法

1.1 材料的采集、處理及觀察

標本的采集: 2018年5月至2019年5月期間分多次進行聚果蜈蚣藻的采集, 采集地點位于模式標本產地山東省青島市的第一海水浴場(120°20′30.275″E, 36°3′27.202″N)、麥島(120°23′46.644″E,36°18′26.784″N)和魯迅公園(120°19′58.555″E,36°3′17.096″N)的低潮帶礁石上或石沼中(表 1)。

表1 聚果蜈蚣藻的采集地點、標本編號和基因登錄號列表Tab. 1 Sampling locations, specimen numbers and gene accession numbers of G. sorocarpus

標本的處理: 將采集后的樣本去除附生藻類等雜質并進行編號, 選擇具有成熟囊果的新鮮活體標本保存于恒溫箱中空運回實驗室用于早期發育及生活史研究; 選擇形態完整的樣本制作成臘葉標本、液浸標本和硅膠干燥標本, 分別用于制作冰凍切片觀察內部結構及提取DNA進行分子分析。

標本的觀察: 樣本的外部形態、內部結構及早期發育過程分別使用解剖鏡和Olympus BX53熒光顯微鏡進行觀察。

1.2 早期發育研究

將采集到的樣本進行篩選和分類選擇新鮮的、生長狀態良好的、完整的四分孢子體和具有成熟囊果的雌配子體, 進行反復沖洗, 必要時可用毛筆刷洗藻體表面,并在解剖鏡下觀察藻體表面是否足夠干凈, 無其他附生雜藻和泥沙等雜質。將脫脂棉進行酒精浸泡處理, 擦拭玻璃器皿以達到消毒目的。將滅菌的載玻片置于玻璃器皿底部,添加滅菌的海水。將清洗過的雌配子體及四分孢子體迅速轉移至不同的器皿中, 并通入氧氣。將藻體置于溫度20℃, 光照強度80 μmol/(m2·s), 光周期(Light∶Dark)12L∶12D的條件下進行孢子的放散。1d 后,檢查載玻片上孢子的釋放量并將合格的載玻片轉移至培養液中, 置于光照培養箱(LRH-250-GB)中培養。采用Olympus BX53熒光顯微鏡定時觀察孢子萌發情況, 用目鏡測微尺測量早期發育過程中各時期孢子直徑大小并記錄, 對原生質體的移動及萌發管的形成過程進行準確描述。每2天更換1次培養液。

1.3 基因序列分析

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取藻體DNA后, 對rbcL和COⅠ基因進行PCR體外擴增、樣品純化并進行測序。引物組合為F57—R753、F654—R1381和F1—R1。詳細的實驗步驟及引物設計的方法參照Yang等[17]和Wang等[7]的實驗。

從GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank)網站獲取了產自中國、韓國和日本的蜈蚣藻屬的亞洲蜈蚣藻、中國產的蜈蚣藻屬的齒狀蜈蚣藻G. serra、臺灣蜈蚣藻G. taiwanese和東方蜈蚣藻G. orientalis等12個種[6—11,18—23]及海膜屬Halymenia的H. floresia和海柏屬Polyopes的P. constrictus[24]2個外群種的rbcL基因序列與本研究中得到的8個聚果蜈蚣藻的rbcL基因序列, 獲取了蜈蚣藻屬11個種[22]及2個外群種海膜屬的H. pseudofloresi和海柏屬P. affinis[22]的COⅠ基因序列與本研究中得到的8個聚果蜈蚣藻的COⅠ基因序列進行分析比對。用軟件ClustalX進行校正和比對[25], 用MEGA6.0軟件分析堿基差異度并構建NJ、MP和ML系統發育樹 , Bootstrap重復1000次[26]。

2 結果

2.1 聚果蜈蚣藻的外部形態

雌配子體藻體直立(圖 1A), 高為5—15 cm, 主枝寬為1.5—2 mm; 單生或叢生; 呈紫紅色; 質地為軟骨質, 較黏滑; 1—2回羽狀分枝; 對生、互生或偏生, 具有長短不一的小羽枝, 呈扁平或棍棒狀, 基部縊縮, 常密集生長在2回羽狀分枝的中部(圖 1B); 囊果近球形, 常聚集在一起呈瘤狀, 稍突出于藻體表面(圖 1B和1C)。聚果蜈蚣藻的雄配子體未見。

圖1 聚果蜈蚣藻雌配子體的外部形態及表面觀Fig. 1 The morphological appearance and surface observation of G. sorocarpus

2.2 聚果蜈蚣藻的內部結構

營養結構: 聚果蜈蚣藻橫切面厚度為510—680 μm,兩端具有7—10層細胞為皮層, 皮層分為內、外皮層, 總厚度為60—70 μm, 外皮層4—6層, 細胞略小,多呈圓形; 內皮層3—4層, 細胞略大, 形狀不規則,以多角形和星形較為常見。中央絲狀區域為髓部,髓部內髓絲錯綜交織, 髓絲長為15—75 μm, 寬為2—3 μm, 皮層和髓部界限明顯(圖 2A和2B)。

生殖結構: 果胞枝生殖枝叢源于內皮層細胞,符合Grateloupia(6cpb-5auxb)型,包含1個主枝及2或3個不育側枝, 均由1個支持細胞承載。果孢枝包含2個細胞, 即壺形果胞和下位細胞, 壺形果胞末端連接一條受精絲指向藻體表面, 受精絲位于藻體外側, 呈彎曲或伸直狀。果胞周圍包括基細胞、下位細胞、亞下位細胞和圓形細胞, 這些細胞均帶有一條不育側枝彎向藻體表面, 形成瓶狀體(圖 2C)。

輔助細胞成熟時, 略大于周圍其他細胞, 呈圓球形, 存在于輔助細胞生殖枝叢的底部。在成熟的輔助細胞周圍可以觀察到5個細胞, 各帶有一條側枝, 每條側枝由10—12個細胞組成。輔助細胞及其周圍細胞共同形成瓶狀體(圖 2D)。

果孢與精子完成受精作用后, 會與下位細胞、基細胞融合, 進而伸出聯絡絲與輔助細胞接觸, 并形成融合復合體, 進而產生產孢絲指向藻體表面,其他未融合的瓶狀體細胞則橫向分裂形成營養絲。產孢絲末端形成若干球形果孢子。營養絲與其周圍的髓絲相互纏繞形成囊果皮, 包被著果孢子,為囊果。成熟囊果直徑為170—230 μm, 孢子囊的頂端有囊孔, 果孢子待成熟后經囊果孔逸出 (圖 2E和2F)。

圖2 聚果蜈蚣藻雌配子體的內部結構Fig. 2 The internal structure of gametophyte of G. sorocarpus

四分孢子體的藻體大小與雌配子體相似(圖 3A),四分孢子囊突出于藻體表面,散生于藻體中上部(圖 3B),待藻體趨于成熟時,部分內皮層細胞分化形成較大的孢子囊母細胞(圖 3C), 孢子囊母細胞經減數分裂, 先形成二分孢子(圖 3D), 最終形成四分孢子, 成熟后呈十字形分裂, 長為40—60 μm, 寬為20—40 μm(圖 3E)。

圖3 聚果蜈蚣藻四分孢子體的形態結構Fig. 3 The morphological structure of tetrasporophyte of G. sorocarpus

2.3 聚果蜈蚣藻的早期發育

聚果蜈蚣藻的囊果突出于藻體表面(圖 4A), 囊果發育成熟后放散出紫紅色的果孢子至載玻片上,果孢子球形, 直徑20 μm左右(圖 4B)。在24h后, 果孢子一端形成萌發管(圖 4C), 并逐漸伸長, 原生質體逐漸向萌發管一端移動, 在原來的位置形成空泡,空泡內含有透明膠狀物質(圖 4D)。當萌發管不再繼續伸長時, 果孢子及膠狀物質間形成透明的隔膜,隨后果孢子開始分裂(圖 4E和4F), 隨著細胞數目逐漸增多, 另一端的透明膠狀物質逐漸變小甚至消失,當空泡及其內的膠狀物質消失時即到達細胞團階段(圖 4G)。當細胞團在水平方向上分化出基細胞及在垂直方向上分化出頂細胞時則到達盤狀體階段(圖 4H)。相鄰的幾個盤狀體會相互靠近發生融合, 形成一個較大的盤狀體, 即盤狀體融合現象(圖 4I和4J)。盤狀體逐漸發育形成直立枝(圖 4K), 直立枝繼續生長發育形成聚果蜈蚣藻幼苗(圖 4L), 四分孢子與果孢子形態大小相似,發育過程無明顯差異。

圖4 聚果蜈蚣藻的早期發育過程Fig. 4 The early development of G. sorocarpus

2.4 rbcL基因序列分析

本研究共獲得了8條rbcL基因序列, 基因序列長度均為1259 bp, 對比矯正后的序列長度為1184 bp。

rbcL基因序列比對(MAGE6.0)結果顯示, 本研究8個樣本的rbcL基因序列無堿基差異, 與產自中國的亞洲蜈蚣藻無差異, 與產自日本和韓國的亞洲蜈蚣藻的堿基差異分別為3 bp(0.248%)和2 bp(0.124%), 且本研究的8個樣本與亞洲蜈蚣藻在系統發育樹中位于獨立的進化支(圖 5); 與蜈蚣藻屬內其他11個種的堿基差異為17(1.505%)—98 bp(8.289%);與外群種P. constrictus和H. floresia的堿基差異分別為155 bp(13.100%)和154 bp(13.009%)。

圖5 基于rbcL基因序列所構建的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on partial rbcL sequences data

2.5 COⅠ基因序列分析

本研究共獲得了8條COⅠ基因序列, 序列長度為641 bp, 對比矯正后的序列共20條, 序列矩陣長度為616 bp。

COⅠ基因序列比對(MAGE6.0)結果顯示, 本研究的8個樣本的COⅠ基因序列無差異, 與產自韓國和日本的亞洲蜈蚣藻無堿基差異, 它們在系統發育樹中位于獨立的進化支(圖 6), 與蜈蚣藻屬內其余9個種的堿基差異為18(2.94%)—80 bp(13.04%); 與作為外群種的P. affinis和H. pseudofloresii的堿基差異分別為107 bp(17.51%)和83 bp(13.59%)。

圖6 基于COⅠ序列所構建的ML系統發育樹Fig. 6 The Maximum Likelihood (ML) tree based on COⅠ sequences

3 討論

本研究對聚果蜈蚣藻和亞洲蜈蚣藻的形態等特征進行觀察比較, 發現二者藻體顏色、分枝類型十分相似(圖 7A; 表 2)。兩者僅在形態學上具有較小的差異: 聚果蜈蚣藻具有1—2回羽狀分枝, 小枝短一般生長在2回羽枝中部, 雌配子體囊果近球形,常聚集在一起呈瘤狀; 亞洲蜈蚣藻具有1—3回羽狀分枝, 囊果隨機散落分布在除固著器以外的整個藻體。蜈蚣藻屬海藻根據生殖結構中助細胞生殖枝叢的不同可分3種類型。其中亞洲蜈蚣藻的生殖結構為(6cpb-5auxb)型, 果胞與下位細胞融合, 輔助細胞沒有融合現象[5]。研究結果顯示聚果蜈蚣藻的生殖結構與亞洲蜈蚣藻完全一致。

表2 聚果蜈蚣藻和亞洲蜈蚣藻形態學特征的比較Tab. 2 Morphological characteristics contrast between G. sorocarpus and G. asiatica

圖7 亞洲蜈蚣藻與聚果蜈蚣藻的外部形態Fig. 7 The external morphological observation of G. sorocarpus and G. asiatica

研究發現, 聚果蜈蚣藻的孢子在萌發時會先形成萌發管并逐漸伸長, 隨后細胞才會進行分裂, 進入盤狀體時期, 發育類型為“間接盤狀體”型, 與亞洲蜈蚣藻的孢子發育類型一致[27]。判斷聚果蜈蚣藻與亞洲蜈蚣藻在形態學和早期發育及生活史水平上為同一種。

利用rbcL基因對進行了形態研究的聚果蜈蚣藻進行分子系統分析構建系統發育樹, 結果顯示本研究的8個聚果蜈蚣藻與產自中國遼寧大連、山東青島的亞洲蜈蚣藻無堿基差異并形成獨立的進化支，與產自韓國和日本的亞洲蜈蚣藻堿基差異為2 bp(0.124%)和3 bp(0.248%)。李芳等[16]提出蜈蚣藻屬海藻的rbcL基因序列堿基差異在0.00—2.00%，均屬于種內差異。基于COⅠ基因構建的系統樹顯示本研究的8個聚果蜈蚣藻與產自韓國和日本的亞洲蜈蚣藻無堿基差異并形成獨立的進化支。因此認為聚果蜈蚣藻與產自韓國和日本的亞洲蜈蚣藻的堿基差異為種內差異。從分子水平上也顯示聚果蜈蚣藻與亞洲蜈蚣藻為同一種。

亞洲蜈蚣藻在6—7月達成熟期, 在6—9月達生長盛期。達成熟期的雌配子體藻體表面具有囊果,因此采集日期的不同, 海藻處于不同的生長期, 有無囊果、囊果的大小及囊果是否聚集都會產生些許差異。由此可見, 海藻采集的地理位置不同和采集地的海水溫度、鹽度等生態環境的不同, 可導致同種海藻在外部形態上略微有些許差別。因此, 在傳統的分類學中只根據某一標本的形態或某一時期標本的形態草率的建立一個新種是沒有說服力的, 還需要利用分子分析的手段, 對進行了形態研究的每個種進行分子系統分析, 進一步確定屬內海藻種間的系統關系及種內的遺傳多樣性, 來進一步驗證經典分類的合理性, 運用分子輔助的形態分類學方法, 得到的結果才具有準確性。

通過分子輔助的形態分類學的方法對聚果蜈蚣藻進行研究, 確定其與亞洲蜈蚣藻為同一種, 根據優先法則, 將其作為亞洲蜈蚣藻的同物異名。