黃芪多糖對食管鱗狀細胞癌細胞肌動蛋白細胞骨架的影響

林玨龍，沈志忠，莊冰蓉，樸中賢，李偉秋，林麗吟

(1．汕頭大學醫學院中心實驗室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫學院第一附屬醫院耳鼻喉科，廣東 汕頭 515041)

食管癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，在我國食管癌屬高發疾病，每年新發病例約40萬。潮汕地區是我國食管癌六大高發區之一，其死亡率一直居高不下[1]。研究食管癌治療新的作用靶點和作用機制不僅是開發新型抗癌藥物應對腫瘤化療的有效手段，而且能夠開發一些解決腫瘤化療耐藥性、糾正腫瘤藥物敏感性的藥物(如中醫藥制劑)以改善化療效果。國內研究在利用中醫藥理論及臨床實踐基礎上，在天然中藥中發現多種具有抗癌作用和逆轉化療耐藥作用的活性物質[2]。黃芪是一種常用的中藥材，是抗腫瘤治療的主要輔助中藥。黃芪的化學成分主要有多糖、皂苷類和黃酮類等，黃芪多糖可通過提高機體的免疫功能而起輔助抗癌作用，能增強化療藥物的敏感性[3-4]。然而，黃芪多糖輔助抗癌的機制并不完全清楚。因此，本研究在食管癌細胞培養液中加入黃芪多糖，構建一個黃芪多糖作用于癌細胞的微環境，觀察和分析黃芪多糖對食管癌細胞肌動蛋白骨架的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低分化食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞由汕頭大學醫學院病理教研室提供；1640培養基、胰酶、青霉素鏈霉素雙抗均購自美國Gibco公司；核糖核酸酶A、碘化丙碇、牛血清白蛋白、熒光素異硫氰酸酯標記鬼筆環肽(Phalloidin-FITC)均購自美國Sigma公司；黃芪多糖購自北京索萊寶科技有限公司。LSM 800激光共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 KYSE-150細胞接種于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的1640培養基中(培養皿內鋪墊有多片蓋玻片，細胞在蓋玻片附著生長)，在37℃，體積分數為5% CO2的培養箱中培養12 h，生長密度為20%～30%時分為食管癌KYSE-150細胞組和KYSE-150細胞+黃芪多糖組，其中黃芪多糖終濃度50 mg/L。繼續培養24 h，生長密度70%～80%。用0.15 mol/L，pH 7.2的PBS緩沖液洗去培養液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS緩沖液洗滌1～2次，4℃保存。

1.2.2 細胞染色 含KYSE-150細胞的載玻片經PBS洗滌、吸凈，20 μL 0.2% Triton X 100處理10 min；PBS洗滌、吸凈，滴加15 μL Phalloidin-FITC(終濃度5～10 μg/mL)標記細胞內纖絲狀肌動蛋白(F-actin)、同步加入10 μL RNA酶(終濃度50 μg/mL)，室溫暗處靜置2 h；PBS洗滌、吸凈，滴加10 μL碘化丙碇(10 μg/mL)標記細胞內DNA，靜置20 min；PBS洗滌、吸凈。將各組含KYSE-150細胞的蓋玻片置于潔凈載玻片，制備可供激光掃描顯微鏡使用的標本。

2 結果

利用Phalloidin-FITC特異標記食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞的F-actin細胞骨架，經激光掃描共聚焦顯微鏡觀測發現KYSE-150細胞沿著細胞膜內層形成粗大束狀的F-actin骨架纖維，呈現由F-actin骨架支撐的細胞延伸交錯形成的侵襲性偽足，癌細胞間彼此侵入，重疊生長；細胞間F-actin纖維支撐起的細胞膜狀似微絨毛的結構短而少(圖1A)。食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞經黃芪多糖誘導后，細胞膜內層F-actin骨架纖維變纖細、豐富，大量的F-actin纖維支撐起細胞膜，促使細胞膜形成豐富的微絨毛狀結構(圖1B)。

圖1 食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞熒光染色 (Phalloidin-FITC，×400)

3 討論

黃芪的主要活性成分有黃芪多糖、皂苷類和黃酮類等。研究顯示黃芪多糖通過提高機體的免疫功能而起輔助抗癌作用，增強化療藥物的敏感性[3-4]；黃芪可增強癌癥患者T淋巴細胞的功能，調節免疫功能[5]；黃芪注射液可增強樹突狀細胞的功能，產生抗肺癌作用[6]；黃芪可促進食管癌患者癌間質的肥大細胞和淋巴細胞的聚集，改善患者的免疫功能[7]。

食管鱗狀細胞癌被診斷時通常已是晚期，患者的5年生存率較低，沒有有效的靶向治療藥物[8]。因此，尋找靶向治療或逆轉食管鱗狀細胞癌的藥物并研究其作用機制至關重要。腫瘤的惡變是一系列多步驟和多階段的過程，腫瘤細胞的抗藥性是造成患者死亡的主要原因[9]。食管鱗狀細胞癌的惡變是癌細胞侵入和遷移的過程，由肌動蛋白細胞骨架的動態組裝促使癌細胞形成偽足和棘突(異形)結構而啟動[10]。細胞中的肌動蛋白有球狀肌動蛋白(G-actin)和F-actin，細胞G-actin的聚合和F-actin的解聚無時無刻不在發生。侵襲性的癌細胞依賴于其肌動蛋白細胞骨架的變化，影響F-actin應力纖維的形成和細胞的伸長[11]。許多癌細胞的侵襲性以F-actin為基礎，細胞膜突出形成侵襲性偽足或侵襲體，侵襲周圍的組織、血管和淋巴管[12-14]。通過調節細胞骨架可以改變細胞遷移，并且在調節癌細胞侵襲性方面有著潛在的作用[15-16]；干擾細胞組分F-actin的聚合，可抑制腫瘤的侵襲和轉移[17]。

本研究利用Phalloidin-FITC特異標記食管鱗狀細胞癌KYSE-150的F-actin細胞骨架，通過激光共聚焦顯微鏡觀測發現：食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞沿著細胞膜內層形成粗大束狀的F-actin骨架纖維，呈現由F-actin骨架支撐的細胞延伸交錯形成的侵襲性偽足，癌細胞間彼此侵入，重疊生長。粗大束狀的F-actin纖維減少了KYSE-150細胞表面的接觸，細胞間F-actin纖維支撐起的細胞膜狀微絨毛的結構短而少，此結構有利于KYSE-150細胞的浸入生長，是惡性生長癌細胞的細胞骨架特征。而經黃芪多糖誘導后，食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞的細胞膜內層F-actin骨架纖維變得纖細、豐富，大量的F-actin纖維支撐起細胞膜，促使細胞膜形成豐富的微絨毛狀似結構，增加了細胞膜間的接觸面積；細胞膜纖細、豐富的微絨毛延伸使細胞間不易形成相互侵入的重疊生長，構成癌細胞良性轉化的細胞膜結構。腫瘤患者的最佳治療方案是非細胞毒性藥物治療，非細胞毒性藥物治療可誘導惡性細胞的良性轉化，通常伴有肌動蛋白細胞骨架的重組、細胞間黏附的提升、細胞運動的抑制和非錨定生長的喪失[18]。由此推測黃芪多糖誘導KYSE-150細胞F-actin骨架的重構，此變化有利于細胞間的信息交流，其結果可能促使癌細胞的良性轉化。綜上所述，黃芪多糖可能具有誘導低分化的食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞良性轉化的作用，可為中醫藥抗腫瘤的輔助治療提供依據。