臨床骨感染診斷中宏基因組測序的應用及發展

李京元，張紅星，陳宇飛，彭 頁，杜俊杰

骨感染是骨科臨床中極具破壞性且難以治療的并發癥，在臨床骨科各專業中均常見，而且治療費用昂貴。2018年國際共識會議的研究組統計了北美骨科所有亞專科感染發生率為0.1%～30.0%，而每位患者為此花費的醫療費用為1.7～15.0萬美元[1]。骨感染的危害巨大，可以形成難以根治的慢性骨髓炎，導致長期住院和多次翻修手術以至于導致內植物失敗，甚至截肢等，從而產生高昂的治療費用，增加社會醫療負擔。對骨感染來說，準確、快速的病原學診斷以制定適當的抗生素治療方案，對縮短感染病程乃至增加治愈率至關重要。微生物培養法一直是骨感染診斷的“金標準”，樣本容量大、成本低和易于學習等優點使其在臨床中廣泛應用。然而由于細菌生物膜等原因，其檢測結果敏感性低且診斷速度慢，在一些厭氧及苛氧菌感染中還需要特定的培養技術。尤其在低毒性感染、特殊病原體感染或取樣前應用抗生素的情況下，甚至可能出現假陰性的結果。在進行骨感染病原學鑒定時，傳統微生物培養法的缺點尤為突出，在缺乏病原學診斷指導的情況下，臨床醫生只能進行經驗性應用廣譜抗生素，常常使患者未能得到及時、有效的治療，導致其預后不良。隨著分子診斷方法不斷興起，以PCR為基礎的分子診斷技術解決了上述部分病原體鑒定的問題。16S rRNA靶向測序是應用高通量技術對細菌具有高度保守性和特異性的基因序列進行測序，可以對病原菌進行微量、快速且準確的鑒定。然而這些方法的敏感性尚有爭議，其次，16S rRNA基因測序是專門針對細菌的檢測方法，不能檢測到真菌或病毒，而且對于細菌種水平鑒定的準確性通常沒有屬水平可靠[2]。而且難以發現未知病原體的存在，無法根據病原體的核酸序列設計引物，成為這類技術存在的最大缺陷[3]。近年來，將宏基因組高通量測序法（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）用于感染性疾病的診斷是一個活躍的研究領域。這一方法可直接對臨床樣本中的核酸進行高通量測序，而不依賴于傳統的微生物培養，能夠快速、客觀的檢測臨床樣本中的多種病原微生物（包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲），尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷，對于骨科臨床中感染性疾病的診斷具有廣闊的應用前景。筆者將對宏基因組測序法的原理，在骨感染診斷中的優勢和應用現狀，以及發展方向進行綜述。

1 宏基因組測序方法的原理

宏基因組是指特定環境中全部生物(微生物)遺傳物質DNA的總和。mNGS是利用新一代高通量測序技術（next-generation sequencing，NGS）檢測臨床樣品中全部微生物的基因組DNA，然后將其與參考基因組數據庫進行比較以鑒定病原體。與傳統培養法相比，其無偏倚、快速、全面、準確等特點尤為突出[4]。

2 mNGS臨床感染性疾病應用

隨著mNGS 技術平臺的完善和臨床研究的增多，mNGS在臨床中感染性疾病的診斷中的運用越來越廣泛。2014年，有研究報道了世界首例通過mNGS診斷的中樞神經系統感染病例[5]，患者因頭痛和發熱在8個月中反復入院治療，嘗試了包括培養和活檢在內的多種檢驗方法仍然無法明確其致病病原體，患者隨后進入了昏迷狀態，最終使用mNGS對患者腦脊液樣本進行檢測，明確為鉤端螺旋體感染，隨后的針對性青霉素治療使患者痊愈出院。顯示了mNGS在臨床感染性疾病診斷中的優勢，奠定了mNGS在臨床感染性疾病診斷中的應用基礎。2019年同一個研究組發表了臨床宏基因組病原學診斷的系統性、多中心研究[6]，應用mNGS對腦脊液進行檢測，比傳統方法檢測到更多的潛在病原體。其結果表明mNGS方法在腦膜腦炎的臨床診斷中是一個具有潛力的方法，在神經侵襲性感染的早期診斷和治療中具有重要的指導意義，同時可以識別新發感染和疾病的表型。通過對臨床樣品直接測序而去除培養步驟，可以進一步減少診斷所需時間，并且可以檢測到通過常規方法未能鑒定到的病原體。因此作為臨床中診斷檢測的一個組成部分，對臨床標本直接進行宏基因組測序具有重要的臨床價值。

3 mNGS在骨感染診斷中的優勢

3.1 敏感性高 細菌種群的多樣性可能是骨感染治療成功率低的原因之一[7]。目前，對骨感染細菌的多樣性以及厭氧和苛氧微生物對這些感染的作用知之甚少。從理論上講，只要擁有足夠長的測序長度、對微生物基因組的多次測序以及良好的參考數據庫，幾乎所有微生物都可以被準確地識別[8]，因此其可以廣泛地識別已知的常見病原體和對未預料到的罕見病原體進行菌株鑒定[9]，甚至發現新的微生物[10]。

mNGS在骨感染中對培養陰性的病例診斷具有特別的優勢。傳統微生物培養法診斷的敏感性低，假陰性問題嚴重。培養陰性是指臨床上有明確感染征象，而傳統培養方法結果陰性的病例。假陰性的原因可能是病原體為不易培養的苛氧菌，或存在需要更長培養時間的病原菌，或術前進行過抗生素治療等。研究發現，在脊柱椎間盤感染中只有43%～78%的病例的活檢培養陽性[11]，在化膿性關節炎中淋球菌性關節炎的培養敏感性僅為50%[12]。一篇前瞻性研究中假體周圍感染（periprosthetic joint infection，PJI）常規組織培養的敏感性為55.73%[13]。也有研究認為，關節置換假體周圍感染培養假陰性的發生率估計高達25%[14]。24%～68%的急性血源性骨髓炎（AHO）和21%～70%的膿毒性關節炎培養陰性[15-16]。Thoendel等[17]報道了應用mNGS在PJI診斷中的大樣本量研究。在細菌培養陽性的患者中，應用mNGS方法94.8%(109/115)的病例能夠檢測出已知病原體，9.6%(11/115)的病例檢測出了其他潛在的致病微生物。在98 例細菌培養陰性的PJI患者中，43例（43.9%）發現了新的潛在的致病微生物。假陰性常常困擾臨床醫生，使抗生素治療缺乏針對性，而經驗性的廣譜抗生素的應用會增加抗生素相關不良反應和并發癥的風險，以及促進耐藥感染的發生。2019年Sigmund等[18]發表的一篇特殊病例報道中，一位慢性PJI女性患者在常規培養及16S rRNA基因PCR檢測結果均為陰性的情況下，應用mNGS檢測出P. micra（微小微單胞菌）的感染，是一種存在于人類口腔和胃腸道的常見的共生專性厭氧球菌。在應用針對性的抗生素治療后癥狀明顯好轉，成功避免了二期的翻修手術。因此，mNGS可以有效的避免假陰性的發生，有助于提高細菌學診斷率，使抗生素的應用更具針對性，改善臨床治療效果。

3.2 檢測速度快 mNGS技術直接對臨床樣本進行測序分析，不依賴微生物的培養，使檢測時間大大縮短，從而使得患者可以盡早選用針對性的抗生素進行治療。培養法通常包括采樣、培養、種屬特異性識別、藥敏試驗等步驟，所需時間從3～14 d不等，而mNGS技術一般可在24 h內給出結果。有文獻指出在化膿性關節炎、骨髓炎及骨折相關感染的診斷中，感染部位樣本的微生物培養時間應至少為10 d，高毒力的病原體(如金黃色葡萄球菌)可在1～2 d內培養，但低毒力病原體的培養可能需要長達14 d，分枝桿菌所需時間更長，同時如果懷疑存在特殊病原菌感染時，還需通知實驗室應用特定的培養技術[18]。2016年Abril等[19]采用mNGS技術對1例60歲男性膿毒血癥患者的血漿進行宏基因組測序，在24 h之內給出了嗜二氧化碳噬細胞菌感染的診斷，迅速且準確。說明mNGS在病原診斷的特異性及速度方面明顯優于傳統方法。對骨感染中病原菌進行更加準確、快速的診斷，將為定向治療提供新的見解，并可能改善臨床預后。

3.3 耐藥信息 此外，mNGS可以在病原菌的耐藥性預測方面給出快速準確的信息[19]。近年來由于抗菌藥物的大量應用，導致細菌耐藥性增強，耐藥性細菌廣泛傳播，新型耐藥菌不斷出現。有報道指出，慢性化膿性骨髓炎所分離出的金黃色葡萄球菌對青霉素和氨芐西林表現出高度耐藥性，耐藥率在90.0%以上，對頭孢噻肟和頭孢唑林等第2代頭孢類藥物的耐藥率在70.0%以上，因此常規臨床用藥不宜作為慢性化膿性骨髓炎的臨床用藥[20]。2013年，Koser等[21]通過mNGS方法明確了多重耐藥肺結核分枝桿菌的耐藥情況，得到了共39個耐藥基因，包括了在標準化實驗室中報告的9種藥物耐藥，同時后期的表型實驗證實了基因組數據的準確性。因此，借助mNGS技術，可以更加完整、快速、準確地了解臨床微生物的耐藥情況，為臨床病原學診斷提供依據，為臨床中治療藥物的選擇提供重要的支持[22]。

3.4 混合感染 mNGS可以提供關于樣品中微生物濃度的定量或半定量數據，在混合性感染疾病的診斷方面表現了較大的潛力與優勢。2019年Wang等[23]指出mNGS比傳統檢測方法具有更廣泛的病原體檢測范圍，mNGS在混合肺部感染的診斷中是一項具有前途的技術，具有潛在的應用價值。

4 發展方向

4.1 進一步提高敏感性 由于臨床樣本采集復雜多樣，臨床標本中的大部分核酸來自宿主，這對病原學檢測的敏感性造成了影響。在分析前階段可以通過使用皂素或其他化學試劑選擇性地溶解人類白細胞，然后用脫氧核糖核酸酶處理釋放的人類基因組，從而使病原體微生物DNA相對富集，提高診斷的敏感性[24]。另一種不同的方法是應用離心等物理方法，去除與人類基因組物質相關的高分子量遺傳內容。一些研究已經證明，應用此方法后病原體核酸相對富集[25]，有助于診斷。在測序階段可以通過宿主損耗法降低mNGS數據中人類宿主背景序列的相對比例，從而提高病原體檢測的分析靈敏度，可以部分改善檢驗結果[26]。

4.2 進一步提高特異性 隨著基因庫數量的增長，數據庫不斷更新，常見病原體的基因組數據是可用的，然而對于罕見的病原體，通常只有特定基因或有限區域基因組被測序，導致罕見病原體或新出現的病原體菌株的參考數據庫不完整，嚴重限制了根據這些序列進行比對的檢測準確性。因此，定期更新完善參考數據庫尤為重要，添加新的病原體參考序列將提高mNGS檢測的特異性。同時，新的參考序列應避免其他物種的相應序列的污染，減少假陽性的風險[27]。

4.3 規范操作流程 骨感染的活檢也可能在樣本采集時在無意中被污染，如細針穿刺過程中皮膚菌群的污染，但常見的污染物(如不動桿菌、鏈球菌、角質菌和葡萄球菌等)也是引發PJI的常見原因[28]，這使情況更加復雜，難以判斷病原體來源，增加了診斷難度。微生物污染無處不在，可能存在于試劑、實驗室環境[29]或正常的人類菌群中[30]。由于mNGS的敏感性，即使是微量的外部污染也會出現在測序數據中。因此，工作流程中的質量控制十分重要，以保證盡可能無菌和無核酸的實驗環境。必要時可以使用陰性對照、試劑評估等方法，以確保實驗室和樣本的交叉污染不會產生假陽性結果[28]。

綜上所述，mNGS是一項革命性的技術，它的出現在多個方面顛覆了骨感染的傳統臨床檢測手段，使其成為一項未來潛在的診斷方法。本綜述闡述了這項新技術用于骨感染診斷的意義及可能性。雖然mNGS技術的出現令人興奮，因為其檢測速度快、準確率高、覆蓋面廣等優勢，目前廣泛應用于基礎及臨床研究當中，但其發展速度往往超過了臨床試驗的驗證和臨床證據的收集過程，要進入臨床成為主要診斷技術仍需解決很多問題。與任何新技術一樣，將mNGS技術應用于骨感染診斷，還需更多高質量研究作為支持，在與傳統診斷方法結果的一致性等方面還需大樣本、系統性的研究加以驗證。隨著mNGS技術成本的降低，操作流程的不斷完善及簡化，其定將成為骨感染診斷的重要組成部分。