他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞的影響及作用機(jī)制

劉秀娟 吳 豫 鄒 鑫 余燕燕 耿燕秋 雙 峰

1.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院腎內(nèi)科，江西南昌 330002；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院檢驗科，江西南昌 330002；3.解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心腎內(nèi)科，北京 100039；4.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院骨科，江西南昌 330002

他索沙坦是一種血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）受體拮抗劑，在臨床上用于降低患者血壓，消除體內(nèi)炎癥[1]。Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是介導(dǎo)腎臟炎癥及纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，Ang Ⅱ能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞中TLR4 的表達(dá)[2-4]。作為Ang Ⅱ受體拮抗劑的他索沙坦可能通過抑制TLR4 對腎臟纖維化起到調(diào)控作用。缺氧缺血是腎臟纖維化中導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的重要原因之一[5-7]。糖氧剝奪細(xì)胞模型多被用于在細(xì)胞水平上模擬缺氧缺血損傷的過程，應(yīng)用此模型可進(jìn)行藥物保護(hù)作用機(jī)制的研究[8-10]。本研究探討他索沙坦對人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HK-2 細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物保藏所；他索沙坦（貨號：B-WM831）購于上海賢鼎生物科技有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ，ColⅠ）、纖維粘連蛋白（Fibronectin）、E 鈣粘蛋白（E-cadherin）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（C/EBPhomologousprotein，CHOP）、TLR4 和β 肌動蛋白（β-actin）一抗（貨號分別為19245、72026、26836、8426、3177、D46F1、143585、8480），二抗（貨號：704S）均購于美國Santa Cruz 公司；pcDNA3.1-TLR4 和空載質(zhì)粒購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中。對照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞；糖氧剝奪組細(xì)胞培養(yǎng)于不含血清的無糖培養(yǎng)基，放置于2% O2，93% N2，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；糖氧剝奪組的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度分別為1、5、10、15 μmol/L 的他索沙坦進(jìn)行培養(yǎng)組成不同濃度的他索沙坦藥物組。培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測 細(xì)胞增殖檢測采用MTT 法，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測定490 nm的吸光度（optical density，OD）值。細(xì)胞增殖率=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 HK-2 細(xì)胞分組處理48 h 后，用4℃預(yù)冷的PBS 將各組細(xì)胞洗滌2 次，隨后加入含0.2% EDTA 的胰酶消化并收集細(xì)胞。加入1 ml 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液，800 r/min 離心5 min 后棄上清，加入200 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。懸液中加入5 mg/L 的Annexin V-FITC 10 μl 和碘化丙啶5 μl，混勻后37℃避光孵育30 min。最后以488 nm 為激發(fā)波長，530 nm 為發(fā)射波長，用流式細(xì)胞儀（Attune NxT，Thermo Fisher）檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.4 Western blot 實驗 HK-2 細(xì)胞分組處理48 h后，用RIPA 細(xì)胞蛋白裂解液裂解各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。以β-actin 為內(nèi)參，同等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，加入待測蛋白一抗，4℃孵育過夜。漂洗后加入二抗，室溫孵育1 h。用X 線曝光分析，結(jié)果用Image-Pro Plus 處理。

1.2.5 TLR4 過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期生長良好的HK-2 細(xì)胞，用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 將TLR4 的過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TLR4 或?qū)φ湛蛰d質(zhì)粒pcDNA3.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。Tas+pcDNA3.1-TLR4組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TLR4 質(zhì)粒后，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 μmol/L 的他索沙坦并用糖氧剝奪培養(yǎng)；Tas+pcDNA3.1組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒后，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 μmol/L 的他索沙坦并用糖氧剝奪培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad prism 5 軟件統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Bonferroni 檢驗。以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞增殖的影響

糖氧剝奪組的細(xì)胞增殖率低于對照組（P ＜0.05）。1、5、10 μmol/L 他索沙坦組與糖氧剝奪組細(xì)胞增殖率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。15 μmol/L 他索沙坦組細(xì)胞增殖率低于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。后續(xù)實驗中選取10 μmol/L 他索沙坦作為糖氧剝奪HK-2細(xì)胞的處理濃度。見圖1。

圖1 他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞增殖的影響

2.2 他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞凋亡的影響

糖氧剝奪組細(xì)胞凋亡率高于對照組（P ＜0.05）。他索沙坦組細(xì)胞凋亡率低于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞凋亡的影響

2.3 他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞腎纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

糖氧剝奪組α-SMA、ColⅠ和Fibronectin 蛋白表達(dá)高于對照組，E-cadherin 蛋白表達(dá)低于對照組（P ＜0.05）；他索沙坦組α-SMA、ColⅠ和Fibronectin蛋白表達(dá)低于糖氧剝奪組，E-cadherin 蛋白表達(dá)高于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞腎纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

2.4 他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

糖氧剝奪組GRP78 和CHOP 蛋白表達(dá)高于對照組（P ＜0.05）；他索沙坦組GRP78 和CHOP 蛋白表達(dá)低于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 他索沙坦對糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

2.5 TLR4 過表達(dá)對他索沙坦減緩糖氧剝奪誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞損傷的影響

糖氧剝奪組TLR4 蛋白表達(dá)高于對照組（P ＜0.05）；他索沙坦組TLR4 蛋白表達(dá)低于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。他索沙坦+pcDNA3.1-TLR4 組TLR4 表達(dá)高于他索沙坦組，細(xì)胞凋亡率高于他索沙坦組，α-SMA、ColⅠ、Fibronectin、GRP78 和CHOP 蛋白表達(dá)高于他索沙坦組，E-cadherin 蛋白表達(dá)低于他索沙坦組（P ＜0.05）。見圖5。

圖5 他索沙坦通過抑制TLR4 表達(dá)對糖氧剝奪誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞損傷的影響

3 討論

臨床上常用血管緊張素受體拮抗劑改善慢性腎病患者的病情，但是其治療原理還未完全闡明[11-12]。他索沙坦是血管緊張素受體拮抗劑之一。本研究結(jié)果顯示，糖氧剝奪處理顯著抑制HK-2 細(xì)胞的生長，低濃度的他索沙坦對糖氧剝奪處理的HK-2 細(xì)胞沒有毒性作用，本研究挑選了10 μmol/L 他索沙坦作為最適的處理濃度。他索沙坦抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡。研究中常用α-SMA、ColⅠ、Fibronectin 和E-cadherin 作為組織纖維化的檢測指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果顯示，他索沙坦顯著抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ和Fibronectin 的蛋白表達(dá)，并促進(jìn)E-cadherin 的蛋白表達(dá)。提示他索沙坦能夠抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和多種腎臟疾病的發(fā)展緊密相關(guān)[14-16]。GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激系統(tǒng)上游的開關(guān)分子[17-19]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)分子[20-22]。本研究結(jié)果顯示，他索沙坦顯著抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞中GRP78 和CHOP 的蛋白表達(dá)，提示他索沙坦有抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的潛力。

腎臟纖維化的過程中伴隨著持續(xù)的炎癥[23]。TLR4作為炎癥的重要調(diào)節(jié)因子，在腎病患者的病變組織、各類腎臟纖維化動物模型中呈現(xiàn)過量表達(dá)，成功抑制或敲除TLR4 可以減輕腎臟纖維化[24-25]。本研究結(jié)果顯示，糖氧剝奪組TLR4 表達(dá)顯著高于對照組，他索沙坦顯著抑制了糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中TLR4的表達(dá)。過表達(dá)TLR4 后他索沙坦處理引起細(xì)胞凋亡減少，腎臟纖維化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白表達(dá)降低的作用被減弱，提示他索沙坦減緩糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞損傷的作用是通過抑制TLR4 產(chǎn)生的。

綜上所述，他索沙坦能夠抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且其作用是通過抑制TLR4 的表達(dá)產(chǎn)生的，這些結(jié)果為今后他索沙坦在腎臟纖維化疾病治療中的應(yīng)用提供新的實驗證據(jù)。